马流感病毒H7N7亚型单抗制备及新疆毒株的分离鉴定

论文摘要

马流行性感冒（Equine influenza）简称马流感,是由正粘病毒科（Orthomyxoviridae）流感病毒属（Influenzavirus）马A型流感病毒（EIV）引起马属动物的一种急性暴发式流行的传染病。与其它流感病毒一样,传播迅速,呈爆发性流行,给养马业和赛马业均带来了一定的损失。因此,若能适时进行快速诊断,查明病原,在流行初期即能检测出马体是否感染了EIV,从而为快速处置预案或早期预防治疗提供诊断依据,最大限度地减少经济损失,就显得尤为重要。为此,本研究拟通过研制出EIV H7N7亚型特异性的单克隆抗体,为进而制备马流感诊断试剂奠定了基础。本研究以蔗糖密度梯度离心方法纯化H7N7亚型马流感病毒,分别免疫Balb/C小鼠后取其脾细胞与SP2/0进行融合,制备了一株能稳定分泌马流感病毒单克隆抗体的细胞株1C6。通过ELISA利Western-blot方法鉴定证明1C6与马传染性贫血病毒（EIAV）、马动脉炎病毒（EAV）、正常鸡胚尿囊液均无交叉反应,1C6的腹水ELISA效价为1:1.6×104。本研究成功研制出抗H7N7亚型的mAb,为EIV的抗原性分析、血清学诊断、疫苗质量监测及流行病学调查等提供了条件。在2007年10月,原计划使用A/equine/miami/63毒株制备H3N8型马流感单克隆抗体,由于新疆、内蒙古、甘肃、武汉等地爆发了大型马流感,情况十分紧急,引起了农业部的高度重视,于是将工作重点转向了新疆马流感病毒的分离与初步鉴定工作。新疆地区是此次马流感的第一个爆发地,将空运回来的棉拭子样品经过一系列处理后接种9日龄SPF鸡胚,新疆地区样品共分离到8株马流感病毒,并用RT—PCR方法进行了初步鉴定,鉴定为H3N8型马流感病毒。为制备H3N8型马流感单克隆抗体提供了新的病原,对于诊断方法的建立更具有针对性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 马流行性感冒简介
• 1.2 病原学
• 1.2.1 病毒的分类
• 1.2.2 病毒的命名
• 1.2.3 病毒形态学特征
• 1.2.4 病毒分子结构及功能
• 1.2.5 病毒的复制与表达
• 1.2.6 病毒的变异
• 1.3 流行病学
• 1.4 临床病状与生理变化
• 1.5 诊断
• 1.6 疫苗与防治
• 1.6.1 灭活疫苗
• 1.6.2 弱毒疫苗
• 1.6.3 亚单位疫苗
• 1.6.4 DNA疫苗
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 毒株、血清、菌种
• 2.1.2 细胞
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 实验动物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 病毒A/equine/Beijing/1/74的复壮与纯化
• 2.2.2 病毒的滴定（HA）
• 2.2.3 病毒的纯化
• 2.2.4 纯化结果的测定
• 2.2.5 动物免疫
• 2.2.6 检测方法的建立
• 2.2.7 细胞融合
• 2.2.8 杂交瘤细胞的筛选
• 2.2.9 有限稀释法克隆杂交瘤细胞
• 2.2.10 细胞的冻存与复苏
• 2.2.11 腹水的制备
• 2.2.12 腹水效价的测定
• 2.2.13 单克隆抗体的特异性分析
• 2.2.14 杂交瘤细胞的稳定性测定
• 2.2.15 单克隆抗体的热稳定测定
• 2.2.16 Western Blot分析
• 2.2.17 新疆毒株的病料采集
• 2.2.18 新疆毒株的分离
• 2.2.19 HA实验与电镜观察
• 2.2.20 RT-PCR鉴定
• 2.2.21 HA、NA基因RT-PCR扩增测序
• 3 实验结果
• 3.1 病毒增殖与纯化
• 3.2 ELISA检测方法的建立
• 3.3 杂交瘤细胞株的建立
• 3.4 腹水的制备与效价测定
• 3.5 单抗的特异性分析
• 3.6 抗体分泌稳定性测定
• 3.7 腹水热稳定性测定
• 3.8 Western bolt分析结果
• 3.9 病毒分离与HA测定
• 3.10 电镜观察
• 3.11 M基因扩增
• 3.12 HA、NA基因扩增
• 3.13 同源性分析及亚型鉴定
• 4 讨论
• 4.1 病毒的繁殖纯化
• 4.1.1 病毒的繁殖
• 4.1.2 病毒的纯化
• 4.2 杂交瘤细胞株的建立
• 4.2.1 SP2/0细胞的培养
• 4.2.2 细胞融合
• 4.2.3 细胞亚克隆
• 4.3 单克隆抗体的鉴定
• 4.4 分离病毒
• 4.5 RT-PCR鉴定
• 4.6 HA、NA基因的扩增与序列比对
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文