农杆菌介导白芥防御素基因转入甘蓝型油菜的研究

论文摘要

油菜（Brassica napus L．）属于十字花科芸苔属，是世界四大油料作物之一，在全球产量中处于第三位，仅次于大豆和棕榈油。近年来，真菌等病害造成了油菜产量和品质的大幅下降，而消除病害所需要的农药投入巨大，同时造成了严重的环境污染。如能通过对油菜进行转基因改良，使其自身具有良好的抗病害能力，将具有重要的经济价值和环保意义。植物防御素（Rlant defensins）是一种存在于多种植物中的小分子（45-54氨基酸）碱性多肽。其保守的含有8个Cys，而形成4个二硫键。因其与动物防御素同源而得名。植物防御素具有广谱高效的抗微生物活性，能有效的杀灭G+、G-、某些真菌、螺旋体、被膜病毒等微生物，而对植物细胞没有伤害，是植物先天性非特异性免疫的重要组成部分。2005年罗勤等从十字花科植物白芥种子中成功地克隆了编码植物防御素的基因，在原核表达载体GTK中对白芥防御素基因进行了融合表达，并通过花序浸染法转入拟南芥中进行表达，以研究防御素基因功能。本研究以甘蓝型优质高产杂交油菜新品种“蜀杂九号”恢复系材料84100-18（Brassica napus L．）为实验材料，以下胚轴为外植体，通过根癌农杆菌EHA-105的介导，将其携带的白芥防御素基因（Sad）转入油菜中，经共培养、抗生素筛选、生根获得了高抗性转化植株。对所获得的转化植株进行了PCR检测结果表明，外源的Sad基因已经整合入油菜基因组中。论文还对影响农杆菌介导法转化效率的主要因素进行了分析讨论。主要实验结果如下：1．通过对比观察外植体的诱导及分化情况，建立并优化了油菜植株的再生体系。试验表明：下胚轴的分化频率高于子叶且离生长点0.5-1cm的下胚轴切段最高；菌液稀释至OD6000.5，浸泡时间1min，共培养2d；农杆菌再悬浮液与共培养基中加入20mg／L乙酰丁香酮可提高转化频率；AgNO3可提高下胚轴芽的分化率；MS+2mg／L6-BA+1mg╱L 2，4-D时芽的分化率最高；卡那霉素起始选择浓度为10mg／L。2．用含有Sad基因的植物表达载体pBI121-Sad的根癌农杆菌转化油菜，对各项转化条件进行优化，确定了农杆菌EHA105转化油菜外植体的最佳条件。确定用植株再生的最佳培养基分别为：Ⅰ无菌苗培养基：MS基本培养基Ⅱ预共培养基：MS+2mg╱L6-BA+1mg╱L 2，4-D+2.5mg／LAgNO3+19.62mg／LAsⅢ筛选培养基：MS+2mg／L 6-BA+2.5m╱LAgNO3+500mg╱L Carb+10mg／L KanⅣ生根快繁培养基：1／2MS+0.15mg／LNAA+250mg╱LCefⅤ摇菌培养基：LB+40mg╱LRif+20mg╱LStr+50mg／LkanⅥ重悬培养基：MS+19.62mg╱L As3．转化后经卡那霉素筛选获得了油菜抗性苗，通过PCR验证，初步证明得到了含外源Sad基因的转基因植株。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 实验材料
• 1.2 菌株和载体
• 1.3 主要试剂
• 1.4 试剂配方
• 1.4.1 细菌培养基
• 1.4.2 油菜组培及转化培养基
• 1.4.3 抗生素的配制
• 1.4.4 激素的配制及其它配制
• 1.4.5 碱裂解法提取质粒溶液
• 1.4.6 植物总DNA提取溶液
• 1.4.7 DNA的琼脂糖凝胶电泳
• 2 方法
• 2.1 植物转基因载体的构建
• 2.1.1 目的基因片段的获得
• 2.1.2 pBI121载体片段的获得
• 2.1.3 重组质粒的构建
• 2.1.4 重组质粒的鉴定
• 2.2 根癌农杆菌 EHA105阳性转化子的获得
• 2.2.1 pBI121-Sad重组质粒载体的获得
• 2.2.2 转化农杆菌EHA105
• 2.3 根癌农杆菌介导的遗传转化
• 2.3.1 无菌苗的获取
• 2.3.2 下胚轴的预培养
• 2.3.3 下胚轴的浸染及共培养
• 2.3.4 诱导愈伤与筛选生芽
• 2.3.5 生根培养与炼苗
• 2.3.6 转基因油菜的PCR检测
• 第二部分 结果与分析
• 1 pBI121载体双酶切
• 2 植物正义和反义表达载体重组质粒的鉴定
• 3 阳性农杆菌转化子的鉴定
• 4 植物叶片总DNA的提取
• 5 Kan抗性油菜PCR检测结果
• 5.1 正向转基因苗检测结果
• 5.2 反向转基因苗检测结果
• 6 炼苗、移栽大田
• 7 进一步的工作
• 8 图版
• 第三部分 讨论与结论
• 1 讨论
• 1.1 油菜植株再生系统的优化
• 1.1.1 最佳外植体的确定
• 1.1.2 培养条件的优化
• 1.2 农杆菌转化体系的优化
• 1.2.1 农杆菌的活化
• 1.2.2 菌液浸泡浓度与时间对转化频率的影响
• 1.2.3 酚类化合物浓度对外植体抗性芽产生的影响
• 3的添加'>1.3 AgNO₃的添加
• 1.4 激素对下胚轴再生芽形成的影响
• 1.5 卡那酶素起始浓度对油菜下胚轴抗性芽产生率的影响
• 1.6 对转基因阳性植株的稳定性分析
• 2 结论与展望
• 2.1 建立了高效的油菜转化体系
• 2.2 获得了抗卡那霉素的再生转基因植株
• 2.3 后续的工作及展望
• 文献综述
• 1 植物防御素的研究进展
• 1.1 抗菌肽
• 1.2 植物抗菌肽
• 1.3 植物防御素
• 1.3.1 植物防御素氨基酸的组成
• 1.3.2 植物防御素的结构
• 1.3.3 植物防御素的分类
• 1.3.4 植物防御素的产生机理
• 1.3.5 防御素的作用机制
• 1.3.6 植物防御素的生理功能
• 1.4 抗菌肽转基因工程局限
• 1.4.1 抗菌肽对转基因植物生长的影响
• 1.4.2 抗菌肽对转基因植物表型的影响
• 1.5 存在的问题与展望
• 2 农杆菌介导的油菜转基因研究进展
• 2.1 根癌农杆菌介导的基因转化机理
• 2.1.1 Ti质拉载体系统
• 2.1.2 T-DNA的转移及其相关基因
• 2.2 影响转化效率的主要因素
• 2.2.1 植物的基因型
• 2.2.2 外植体及其生理状态
• 2.2.3 农杆菌菌株对转化效果的影响
• 2.2.4 外植体与农杆菌共培养条件对转化效果的影响
• 2.2.5 抗生素对转化的影响
• 2.3 转基因植株的筛选
• 2.4 芸苔属植物转基因的遗传与表达
• 2.5 国内外主要研究现状
• 2.6 存在的主要问题及展望
• 2.6.1 提高外源基因转化率并建立高频再生体系
• 2.6.2 提高对转基因油菜中外源基因的表达的调控及其遗传稳定性
• 2.6.3 与传统常规育种相结合
• 2.6.4 转基因油菜的安全性问题
• 3 转基因植株鉴定
• 3.1 外源基因整合的鉴定
• 3.2 外源基因转录水平的鉴定
• 3.3 外源基因表达蛋白的检测
• 3.4 报告基因的酶法检测
• 参考文献
• 在读期间的科研成果
• 致谢