细胞酸碱内环境对白血病细胞分化及耐药的影响及相关机制研究

论文摘要

背景：伊马替尼（格列卫STI571）是目前治疗CML的有效药物。但原发或继发性耐药是CML尤其是急变期患者应用伊马替尼遇到的最大问题。为此,进一步探讨和了解BCR/ABL下游的分子网络,寻找不依赖BCR/ABL激酶的新的有效治疗靶点有望解决这一耐药问题。目的：根据我们已报道的研究结果表明,特异性抑制钠氢交换蛋白1（NHE1）所致的细胞内酸化能有效逆转P-糖蛋白（Pgp）介导的白血病细胞多药耐药。而伊马替尼已被证明是Pgp的底物,其介导的药物外排是CML患者耐伊马替尼的机制之一。因此本研究意在探讨NHE1与Pgp在CML患者中的关系及在耐药中的作用。方法：对2008年10月～2010年9月我院收治的CML患者19例、急性髓系白血病AML9例、急性淋巴细胞白血病ALL 11例进行研究,并收集5例正常供者骨髓为阴性对照。分离骨髓单个核细胞,应用激光共聚焦显微镜测定患者原代白血病细胞内pH值（Intracellular pH, pHi）,实时定量RT-PCR及Western blot技术检测Pgp基因及蛋白表达,并统计pH1与Pgp表达的相关性。用NHE1特异性抑制剂Cariporide及高钾缓冲溶液对细胞系进行酸化处理后,共聚焦及实时定量RT-PCR测患者细胞内pH值以及Pgp表达水平的变化,流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测荧光染料罗丹明123（Rhl23）及阿霉素（DOX）在细胞内的蓄积,MTT及集落形成实验考查细胞对药物敏感性。并进一步考察Cariporide及高钾缓冲溶液对原代白血病细胞ERK1/2、ERK5、p38 MAPK、JNK磷酸化水平的改变。继而利用NHE1抑制剂和高钾缓冲溶液对敏感株K562及耐药株K562/DOX, K562/G01细胞系进行处理,测定细胞内pH值（Intracellular pH, pHi）,罗丹明123（Rh123）及阿霉素（DOX）在细胞内的蓄积,P-糖蛋白（Pgp）基因表达变化,Pgp蛋白水平以及ERK1/2、p38 MAPK、JNK磷酸化水平。进一步应用ERK1/2、p38 MAPK、JNK特异性抑制剂PD98059、SB203580、SP600125以及siRNA干扰的方法考察MAPK信号通路在该过程中的作用。结果：细胞内pH值测定显示,BCR-ABL阳性和阴性组细胞内pH值均高于正常组,相关性分析显示BCR-ABL阳性组细胞内pH值与Pgp基因表达呈正相关（r2=0.3439）,而BCR-ABL阴性组细胞内pH值与Pgp基因表达无相关性。将BCR-ABL阳性样本分为初治及复发组,初治组细胞内pH值平均为7.11,明显低于复发组的7.32。与初治组相比,复发组Pgp基因及蛋白均有不同程度的过表达,用NH1特异性抑制剂Cariporide及高钾缓冲溶液处理患者细胞后,复发组患者细胞内pH值水平下降,Pgp mRNA和蛋白表达下调,Rb123及阿霉素在细胞内的蓄积增加,且对伊马替尼的敏感性增强,而初治组中未见明显变化。随着细胞内pH的降低,复发组p38MAPK及ERK5蛋白激酶磷酸化水平呈下降趋势,ERK1/2及JNK蛋白激酶磷酸化水平呈上升趋势。初治组ERK1/2及JNK蛋白激酶磷酸化水平同样呈上升趋势,而p38 MAPK及ERK5蛋白激酶磷酸化水平未见显著改变。Pgp高表达的耐药株K562/DOX及K562/G01细胞的细胞内pH值显著高于敏感株K562细胞（P<0.05）,且K562/DOX伴随较强的Rhl23及DOX外排能力。抑制NHE1活性可有效增强K562/DOX及K562/G01细胞对伊马替尼的敏感性,并抑制细胞中Pgp基因及蛋白水平的表达（P<0.05）；另外抑制NHE1活性可显著减少K562/DOX细胞内Rh123和DOX的外排,且具有细胞内pH值及时间依赖性。而敏感株K562细胞中PgP表达及药物外排能力并不受NHE1抑制剂的影响（P>0.05）。随着细胞内pH的降低,K562/DOX及K562/G01细胞中p38 MAPK蛋白激酶磷酸化水平呈下降趋势,ERKl/2蛋白激酶磷酸化水平呈上升趋势,JNK蛋白激酶磷酸化水平呈上升趋势。特异性的p38 MAPK抑制剂SB203580可与NHE1抑制剂协同下调Pgp基因及蛋白水平的表达。另外,ERK1/2蛋白激酶抑制剂PD98059及JNK蛋白激酶抑制剂SP600125可致p38 MAPK蛋白激酶磷酸化水平上升,提示ERK1/2和JNK可能抑制p38 MAPK激酶的活性。结论：抑制NHE1活性能够显著降低BCR-ABL阳性患者细胞中Pgp蛋白表达和功能,增加Rh123及阿霉素在细胞中的累积,并增加细胞对伊马替尼的敏感性,为逆转CML耐药提供了新的潜在治疗靶点。背景：白血病是一类由基因突变导致的造血系统恶性肿瘤,可使增殖失调,分化受阻,以及造血祖细胞生存延长[1]。研究发现CoCl2模拟低氧环境和低氧孵箱培养能在体外抑制急性髓系白血病（AML）细胞浸润并诱导其分化[2-5]。另外,间歇性低氧能够显著延长移植的白血病小鼠生存时问,并且以非诱导凋亡方式抑制白血病细胞浸润至外周血、骨髓、肝和脾以上研究揭示了白血病与低氧之间的关系,但忽略了微环境对白血病发生发展的影响,如低氧条件下细胞内pH的改变对白血病发生发展的影响。钠氢交换蛋白（Na+/H+exchanger, NHE1）是一类存在于细胞膜表面的离子转运蛋白家族。它通过将细胞内H+与胞外Na+进行交换来调控细胞内pH的动态平衡,影响细胞的体积,运动、分化和凋亡等,从而参与许多复杂的生理和病理过程[6,7]。以此为基础,本研究以慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞为考察对象,意在探讨低氧环境对K562细胞分化的影响,以及NHE1在其中所发挥的作用。目的：本文主要探讨低氧微环境对慢性粒细胞白血病细胞系K562分化的影响,以及钠氢交换蛋白1（NHE1）在该过程中的作用。方法：利用低氧模拟物CoCl2或于低氧（2%O2、5%CO2和93%N2）环境中培养K562细胞；应用流式细胞术测定白血病细胞内pH值（Intracellular pH, pHi）及细胞表面分化抗原表达,瑞士染色及电镜观察细胞形态,实时定量RT-PCR及Western blot技术检测NHE1基因及蛋白表达。用NHE1特异性抑制剂Cariporide及shRNA干扰NHE1表达后,流式细胞术检及实时定量RT-PCR测细胞内pH值,NHE1表达水平及髓系分化相关基因表达的变化。并进一步考察细胞内ERK1/2、p38MAPK、JNK磷酸化水平的改变。结果：与对照组相比,低氧培养的K562细胞表现出成熟相关的形态学改变并伴随CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBPa）的mRNA水平上调。特异性NHE1抑制剂Cariporide预处理能够促进低氧诱导的K562细胞分化。Cariporide处理后K562细胞的p38和ERK5蛋白激酶磷酸化水平显著增强。结论：低氧及低氧模拟物能够诱导K562细胞系分化。抑制NHE1活性协同促进低氧诱导的K562细胞分化,其机制可能是通过增强细胞内MAPK蛋白激酶磷酸化水平,从而促进K562细胞分化。

论文目录

• 第一部分 细胞酸碱内环境对白血病细胞耐药的影响及相关机制研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 细胞酸碱内环境对白血病细胞分化的影响及相关机制研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录一 英语缩写词和代码
• 附录二 在学期间发表论文和会议报告
• 致谢