红豆杉紫杉烷13a-羟基化酶基因的克隆及表达调控的研究

论文摘要

紫杉醇（Taxol）是从紫杉树皮中分离提取到的天然抗肿瘤物质,是迄今为止最具抗癌活性的天然化合物之一,紫杉酚能够抑制细胞在G2-M期增殖,阻断有丝分裂,从而有效抑制癌细胞增生。然而紫杉醇在植物体内含量相当低,加之其生长缓慢,这对紫杉醇的进一步开发利用造成了很大的困难。紫杉烷13α–羟基化酶（Taxane 13α-hydroxylase）属于依赖细胞色素P450的单加氧酶,为紫杉醇合成途径的关键羟化酶,是紫杉醇及其半合成前体生物合成调控的十分重要的靶标。本研究克隆得到我国东北红豆杉（Taxus cuspidata）紫杉烷13α-羟基化酶基因,构建了其植物表达载体并转化烟草。在此基础上克隆了几个可能与紫杉烷13α-羟基化酶基因相作用的microRNA（miRNA）基因,构建其植物表达载体并进行了其中miRNA基因与紫杉烷13α-羟基化酶基因共转化试验。主要研究内容和研究结果如下:（1）本研究克隆得到东北红豆杉13OH的基因全长,将它与报道的13OH基因进行同源性比较后发现9个碱基有差异,同源性为99.38%。（2）根据不同的报告基因要求,成功构建了13OH基因在Pcambia1305.1和pcambia1304及pEGAD上的三种植物表达载体,分别含有GUS基因、GUS和mGFP5、EGFP作为报告基因。（3）将构建在Pcambia1305.1的13OH基因成功转化到烟草中,获得可在烟草中表达13α-羟基化酶基因的转基因烟草植株。（4）从水稻及拟南芥中克隆出miR160e、miR164e、miR165a、miR166m、miR169d小调节子前体,测序结果表明除164e有一个碱基差异166m有两个碱基差异外,其余同源性为100%。（5）分别构建了miR160e、miR164e、miR165a、miR166m、miR169d在Pcambia1305.1上和miR165a、miR169d在pEGAD上的七种植物表达载体,便于不同的筛选。（6）瞬时转化GUS染色结果显示miR169d对13OH基因的表达有很强的抑制作用。（7）荧光定量PCR结果显示miR165a可能对13OH基因有小幅度的影响。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 紫杉醇生物合成研究现状
• 1.2 微小RNA 基因的研究概况
• 1.2.1 微小RNA 技术的研究进展
• 1.2.2 微小RNA 特征及其功能
• 1.2.3 用微小RNA 技术研究紫杉烷13α-羟基化酶基因的意义
• 1.3 研究目标和主要研究内容
• 1.3.1 研究目标
• 1.3.2 主要研究内容
• 1.3.2.1 紫杉烷13α-羟基化酶基因的克隆
• 1.3.2.2 正向表达载体的构建
• 1.3.2.3 微小RNA 载体的构建
• 1.3.2.4 小RNA 载体对烟草的转化研究
• 1.3.2.5 小RNA 载体对红豆杉的转化研究
• 1.3.2.6 转基因材料分析
• 1.3.2.7 小RNA 功能的确定
• 1.3.3 研究技术路线
• 第二章 13α-羟基化酶植物表达载体的构建
• 2.1 紫杉烷13α-羟基化酶基因的克隆
• 2.1.1 试验材料与试剂
• 2.1.2 试验方法
• 2.1.2.1 红豆杉基因组DNA 的提取
• 2.1.2.2 红豆杉叶片RNA 的提取及反转录
• 2.1.2.3 目的基因13OH 引物的设计
• 2.1.2.4 红豆杉13OH 基因的克隆与测序
• 2.1.3 结果与分析
• 2.1.3.1 红豆杉基因组DNA 及RNA 的检测
• 2.1.3.2 紫杉烷13OH 基因的克隆和鉴定结果
• 2.2 紫杉烷13α-羟基化酶植物表达载体的构建
• 2.2.1 试验材料与试剂
• 2.2.2 试验方法
• 2.2.3 结果与分析
• 2.3 紫杉烷13α-羟基化酶植物表达载体的电转化
• 2.3.1 农杆菌GV3101 电转化感受态的制备
• 2.3.1.1 试剂配制
• 2.3.1.2 农杆菌感受态细胞的培养
• 2.3.1.3 制备感受态农杆菌
• 2.3.2 紫杉烷13α-羟化酶载体电击转化农杆菌GV3101
• 第三章 小RNA 载体的构建
• 3.1 构建在 pCAMBIA1305.1 中的五种小 RNA 载体
• 3.1.1 试验材料与试剂
• 3.1.2 试验方法
• 3.1.2.1 五种小RNA 前体的克隆
• 3.1.2.2 小RNA 表达载体的构建
• 3.1.3 结果与分析
• 3.1.3.1 五种小RNA 前体的克隆鉴定
• 3.1.3.2 克隆所得片段的PCR 及测序检测
• 3.1.3.3 构建微小RNA 载体的检测
• 3.2 构建在荧光载体 pEGAD 上的两种小 RNA 载体
• 3.2.1 试验材料与试剂
• 3.2.2 试验方法
• 3.2.2.1 165a、169d 的引物设计及克隆
• 3.2.2.2 小RNA 表达载体的构建
• 3.2.3 结果与分析
• 3.2.3.1 165a，169d 的克隆
• 3.2.3.2 构建到荧光载体上的检测
• 3.3 微小RNA 载体的电转化
• 第四章 红豆杉及烟草的遗传转化研究
• 4.1 烟草的遗传转化研究
• 4.1.1 13OH 转基因烟草植株的获得
• 4.1.1.1 试验材料与试剂
• 4.1.1.2 试验方法
• 4.1.1.3 PCR 及GUS 染色结果
• 4.1.2 小调节子载体转化13OH 阳性转基因烟草植株
• 4.1.2.1 试验材料与试剂
• 4.1.2.2 试验方法
• 4.1.2.3 瞬时表达结果
• 4.2 红豆杉遗传转化的研究
• 4.2.1 试验材料与试剂
• 4.2.2 试验方法
• 4.2.2.1 农杆菌真空渗透法转化红豆杉幼苗
• 4.2.2.2 红豆杉叶片RNA 的提取
• 4.2.2.3 Real-time PCR 检测
• 4.2.3 结果分析
• 第五章 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 5.3 展望
• 参考文献
• 附录
• 在读期间的学术研究
• 致谢