大豆疫霉无毒基因PsAvr3b的克隆

论文摘要

大豆疫霉(Phytophthora sojae)侵染大豆(Glycine max)引起的大豆根腐病是威胁世界大豆生产的毁灭性病害之一,每年造成的经济损失高达20多亿美元。大豆疫霉分泌的无毒蛋白和大豆产生的抗病受体之间的相互识别直接决定着大豆根腐病害的发生,符合Flor的“基因对基因”假说。目前在大豆生产中,合理利用大豆的抗病品种也一直是控制大豆疫霉根腐病发生的最有效方法。因此,在分子水平上阐述大豆疫霉无毒蛋白和大豆抗病受体的互作机理是解释病害发生机制和设计大豆根腐病防控技术的根本途径。目前,随着多个疫霉菌基因组测序工作的完成,对已克隆疫霉菌无毒基因的研究陆续发现：无毒基因均含有RXLR寄主细胞定位信号、在局部基因组中存在多拷贝、侵染阶段转录表达量显著升高以及在不同的小种中具有序列多态性。这些特征的发现为进一步克隆疫霉菌新无毒基因奠定了研究基础。大豆疫霉分泌无毒蛋白与大豆产生的抗病受体两者之间的相互作用决定着大豆对大豆疫霉菌的抗病与感病。本研究为了进一步克隆新无毒基因Avr3b,将对应的大豆疫霉无毒菌株P6497和毒性菌株P7076之间进行杂交,开发利用两个CAPS (Cleaved Amplified Product Sequence)标记筛选杂合子F1代。对80个单卵孢子后代进行筛选后鉴定发现了3个杂合子,其杂交率为3.8%。通过对F1代进行自交获得了72个F2代个体,对该群体的遗传分析发现, F2代群体中的无毒菌株与毒性菌株的分离比率为52：20,x2值为0.1667,小于x20.05的值,符合3：1的期望值,推断Avr3b极有可能受一个单显基因控制。这些结果为该基因的定位和克隆提供遗传学支持。对已经克隆的卵菌无毒基因的研究发现,这类基因都具有分泌信号肽和RXLR寄主细胞定位信号。本研究通过对大豆疫霉菌EST、Microarray以及Solexa全转录组三个转录数据库进行综合分析,筛选大豆疫霉菌中表达的RXLR基因,结果表明有118个RXLR基因在游动孢子萌发和侵染阶段表达。对这118个RXLR基因在无毒菌株P6497和P7064以及毒性菌株P7074和P7076中进行序列多态性比对,共发现有15个RXLR基因在无毒菌株中没有多态性而在毒性菌株中存在多态性。结合先前的基因拷贝数结果,我们一共获得7个符合无毒基因Avr3b特征的候选基因。针对这些候选基因设计CAPS标记并对其进行表型与基因型的共分离分析,发现PsAvh307的基因型和PsAvr3b的表现型完全吻合,初步证明PsAvh307为无毒基因PsAvr3b,同时基因枪瞬时结果表明PsAvh307为PsAvr3b。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 上篇 文献综述
• 第一章 卵菌中无毒基因及其特征的研究进展
• 1 卵菌无毒基因的克隆
• 1.1 卵菌无毒基因的定位
• 1.2 卵菌中已经克隆的无毒基因
• 1.2.1 Phytophthor sojae中克隆的无毒基因
• 1.2.2 Phytophthor infestans中克隆的无毒基因
• 1.2.3 Hyaloperonospora parasitica中克隆的无毒基因
• 2 卵菌无毒基因的基因组结构特征
• 3 卵菌无毒基因的基因特征
• 4 卵菌无毒基因的转录特征
• 5 卵菌无毒基因的多态性特征
• 参考文献
• 下篇 研究内容
• 第一章 大豆疫霉无毒基因定位群体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株
• 1.2 供试大豆
• 1.3 供试大豆幼苗的准备
• 1.4 大豆疫霉菌致病性的测定
• 1.5 基因组DNA的提取
• 1.6 CAPS标记的设计
• 1.7 PCR扩增程序和酶切体系
• 1.8 大豆疫霉F1代的获得
• 1.9 大豆疫霉F2代群体的获得
• 2 结果与分析
• 2.1 大豆疫霉亲本菌株在Rps3b大豆上的毒性测定
• 2.2 杂合F1标记的筛选和验证
• 2.3 杂合F1代的筛选
• 2.4 F1代的毒性测定
• 2.5 F2代群体毒性特征的遗传分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 无毒基因PsAvr3b的候选基因分析
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株
• 1.2 基因组DNA的提取
• 1.3 PCR扩增和酶切检测
• 1.4 RNA的提取
• 1.5 信息分析路线
• 1.6 基因的信号肽及多态性比对
• 1.7 CAPS标记的设计
• 1.8 植物基因枪瞬时表达
• 2 结果与分析
• 2.1 RXLR基因的表达分析
• 2.2 表达RXLR基因的信号肽及RXLR-dEER保守序列分析
• 2.3 表达RXLR基因的拷贝数分析
• 2.4 表达RXLR基因的序列多态性分析
• 2.5 7个RXLR基因符合PsAvr3b基因特征
• 2.6 F2群体中PsAvh307的基因型与PsAvr3b的表型完全吻合
• 2.7 PsAvh307在Rps3b大豆上引起特异性细胞死亡
• 3 讨论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的研究论文
• 致谢