鸡传染性支气管炎病毒陕西分离株的鉴定与M、N基因的遗传变异分析

论文摘要

鸡传染性支气管炎（Infectious Bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus,IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触传染性的呼吸道疾病,给世界养禽业造成了巨大的经济损失。IBV主要侵害鸡的呼吸系统、消化系统及泌尿生殖系统。IBV众多的血清型及其基因组的不断变异对IB的免疫防控造成了很大的困难,而且引起的疫苗免疫失败的现象越来越多。许多学者认为大量变异株的出现与活毒疫苗的应用有关,但目前我国IBV地方流行株的基因序列还不够完备,分子生物学方面有待更深入研究。因此,对地方分离株的分离鉴定及遗传变异的研究显得尤为重要。本研究从陕西分离到的两毒株进行了M、N基因的克隆及遗传变异分析。主要获得以下结果:1.从临床疑似鸡传染性支气管炎疾病的发病鸡群中先后分离到2株病毒,经过接种鸡胚、血凝试验、鸡胚矮小试验及动物回归试验,通过鉴定,2毒株均为鸡传染性支气管炎病毒,而且具有很强的嗜肾性和致病力。2.参照GenBank中收录的IBV M基因序列,设计合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增IBV SX-H09株和SX-W09株的M基因,扩增产物克隆测序后,测序结果与H52、W118、Ark99等参考毒株进行序列分析。结果表明,SX-H09株M基因全长678 bp,编码225个氨基酸,而SX-W09株M基因全长670 bp,编码222个氨基酸,两毒株与参考毒株的核苷酸相似性和氨基酸相似性分别为86.5%～99.6%和84.5%～99.6%。两毒株都存在碱基的突变、插入和缺失。遗传进化树显示SX-H09株与DY07株亲缘关系较近,SX-W09株与其他毒株亲缘关系均较远。3.用RT-PCR方法扩增IBV SX-W09株的N基因并测序,与GenBank所收录IBV毒株的N基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比较,建立N基因系统发育进化树。结果表明, SX-W09株N基因全长1230 bp,编码一条由409个氨基酸组成的多肽;其核苷酸与Ark99、H120、Gray等毒株的相似性为86.5%～89.9%,氨基酸相似性为89.0%～94.1%。SX-W09株存在碱基的突变。SX-W09株与Ark99、H120、Gray等其他参考毒株的亲缘关系均较远。4.将IBV SX-W09株N基因PCR产物经BamHⅠ和HindⅢ双酶切克隆至原核表达载体pET-32a（+）,构建重组表达载体,转化BL21（DE3）,经IPTG诱导后纯化蛋白,用纯化的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,用ELISA和Western blot检测制备的抗体。结果表明,成功构建原核表达载体,ELISA检测多克隆抗体效价为1:12800,Western blot检测具有良好的反应性,可以特异性识别IBV N蛋白。本研究分离鉴定了2株IBV陕西地方流行毒株,通过对毒株M、N基因核苷酸序列分析、遗传进化关系分析以及N蛋白在原核系统的高效表达,为IBV的防治提供参考。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 鸡传染性支气管炎研究进展
• 1.1 病原研究
• 1.1.1 病原形态学特征
• 1.1.2 病毒的培养增殖
• 1.2 IBV 诊断方法
• 1.2.1 病原的分离鉴定
• 1.2.2 血清学诊断方法
• 1.2.3 分子生物学诊断方法
• 1.3 分子生物学研究进展
• 1.3.1 IBV 基因组
• 1.3.2 IBV 主要结构蛋白及功能
• 1.4 展望
• 试验研究
• 第二章 鸡传染性支气管炎病毒陕西地方株的分离鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 病料
• 2.1.2 鸡胚及雏鸡
• 2.1.3 试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 方法
• 2.3.1 流行病学调查
• 2.3.2 病料处理
• 2.3.3 鸡胚接种与传代
• 2.3.4 病毒的鉴定
• 2.4 结果
• 2.4.1 流行病学调查
• 2.4.2 病毒的鉴定
• 2.5 讨论
• 2.6 小结
• 第三章 鸡传染性支气管炎病毒SX-H09 株、SX-W09 株M 基因的克隆及分子遗传变异分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 毒株
• 3.1.2 鸡胚
• 3.1.3 载体与菌株
• 3.1.4 主要试剂
• 3.1.5 引物
• 3.1.6 IBV M 基因参考毒株名称及GenBank 登录号
• 3.1.7 培养基的配制及常用溶液的配制
• 3.1.8 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 IBV SX-H09 株、SX-W09 株病毒增殖与RNA 的提取
• 3.2.2 RT-PCR
• 3.2.3 PCR 产物的纯化与回收
• 3.2.4 PCR 产物的连接与转化
• 3.2.5 重组质粒pMD18-T-M（SX-H09）、pMD18-T-M（SX-W09）的提取
• 3.2.6 重组质粒pMD18-T-M（SX-H09）、pMD18-T-M（SX-W09）酶切鉴定
• 3.2.7 阳性质粒的序列测定
• 3.2.8 IBV SX-H09 株、SX-W09 株M 蛋白一级、二级结构和抗原表位的预测分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 SX-H09 株、SX-W09 株M 基因的RT-PCR 扩增
• 3.3.2 重组质粒pMD18-T-M（SX-H09）、pMD18-T-M（SX-W09）酶切鉴定
• 3.3.3 IBV SX-H09 株、SX-W09 株M 基因的核苷酸序列测定
• 3.3.4 IBV 不同毒株M 基因的核苷酸和氨基酸相似性分析
• 3.3.5 IBV SX-H09 株、SX-W09 株与参考株M 基因的核苷酸及推导的氨基酸序列比较
• 3.3.6 IBV SX-H09 株、SX-W09 株M 基因进化分析
• 3.3.7 IBV SX-H09 株、SX-W09 株M 蛋白一级、二级结构预测
• 3.3.8 IBV SX-H09 株、SX-W09 株M 蛋白抗原表位预测
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 鸡传染性支气管炎病毒SX-W09 株N 基因的克隆
• 4.1 材料
• 4.1.1 毒株
• 4.1.2 鸡胚
• 4.1.3 载体与菌株
• 4.1.4 主要试剂
• 4.1.5 引物
• 4.1.6 IBV N 基因参考毒株名称及GenBank 登录号
• 4.1.7 培养基的配制及常用溶液的配制
• 4.1.8 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 IBV SX-W09 株病毒增殖与RNA 的提取
• 4.2.2 N 基因cDNA 链的合成
• 4.2.3 PCR 扩增
• 4.2.4 PCR 产物的回收纯化
• 4.2.5 PCR 产物的连接与转化
• 4.2.6 重组质粒pMD18-T-N 的提取
• 4.2.7 重组质粒pMD18-T-N 酶切鉴定
• 4.2.8 阳性质粒的序列测定
• 4.2.9 SX-W09 株N 蛋白一级、二级结构和抗原表位的预测分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 SX-W09 株N 基因的扩增
• 4.3.2 pMD18-T-N 重组质粒酶切鉴定
• 4.3.3 IBV SX-W09 株N 基因的核苷酸序列测定
• 4.3.4 IBV 不同毒株N 基因的核苷酸和氨基酸相似性分析
• 4.3.5 IBV SX-W09 株与参考株N 基因的核苷酸及推导的氨基酸序列比较
• 4.3.6 IBV SX-W09 株N 基因进化分析
• 4.3.7 IBV SX-W09 株N 蛋白一级、二级结构预测
• 4.3.8 IBV SX-W09 株N 蛋白抗原表位预测
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 鸡传染性支气管炎病毒SX-W09 株N 基因在大肠杆菌中的表达及产物免疫活性检测
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌株、质粒及实验动物
• 5.1.2 引物设计与合成
• 5.1.3 主要试剂
• 5.1.4 常用溶液的配制
• 5.1.5 实验仪器
• 5.2 方法
• 5.2.1 IBV SX-W09 株N 基因原核表达载体的构建
• 5.2.2 重组质粒pET32a-T-N 在大肠杆菌中的表达及鉴定
• 5.2.3 纯化重组蛋白制备抗原
• 5.2.4 核蛋白多克隆抗体的制备
• 5.2.5 间接ELISA 检测抗血清的效价
• 5.2.6 Western Blot 检测N 蛋白的特异性
• 5.3 结果
• 5.3.1 重组质粒的构建及鉴定
• 5.3.2 重组核蛋白基因的表达和鉴定
• 5.3.3 抗血清ELISA 检测结果
• 5.3.4 Western Blot 特异性检测
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介