琯溪蜜柚和度尾蜜柚自交不亲和性观察及相关基因克隆

论文摘要

自交不亲和性（self-incompatibility SI）是显花植物特有的抑制自体花粉受精的一种能力。在自交不亲和性系统中，遗传上由单一位点控制的，这一位点称为S-locus。目前，分子水平显示有三种类型：孢子体型自交不亲和和两种不同的配子体型自交不亲和。琯溪蜜柚和度尾蜜柚瘪籽也是由于自交不亲和性引起的，为此，本论文对两品种自交不亲和性进行了课题研究和讨论。内容包括：1、用荧光显微技术对琯溪蜜柚（Citrus grandis cv．Guanxi pomelo）和度尾蜜柚（Citrus grandis cv．Duwei pomelo）自交和互交亲和性进行了观察。发现两品种自交和互交花粉在柱头都萌发正常。但自交花粉管在进入柱头组织后，大部分花粉管在伸长过程出现破裂，伴随有内容物渗出，在花柱道内缘有胼胝质出现，但仍有部分花粉管能正常生长进入子房，并从胚柄处进入胚珠，在珠心组织里，观察到胼胝质的积累，其中大多数琯溪蜜柚和少数度尾蜜柚胚珠的胚囊位置出现强烈的荧光亮点。而互交的胚珠中没有观察到这些现象。由此可见，两品种的自交组合在花粉管进入柱头组织后直至进入子房、胚珠的整个伸长过程中，存在一系列的不亲和反应。2、对两品种花粉在雌蕊不同部位抽提液中萌发和伸长状态进行了观察。结果表明，琯溪蜜柚和度尾蜜柚自交不亲和识别和阻抑部位主要存在于子房，柱头仅有轻度的自交不亲和识别反应和阻抑作用。这与报道的其他自交不亲和柚类自交不亲和识别和阻抑部位表现在花柱不相一致。3、分别将雌蕊的柱头、花柱和子房进行短截，移植到培养基上进行播种花粉，以观察雌蕊的不同部位对花粉的萌发和花粉管伸长的影响。实验表明在花粉在三个部位都能正常萌发和伸长，在花柱组织中同样没有异样出现；琯溪蜜柚和度尾蜜柚花粉在本品种子房里出现了相似的强烈不亲和反应；并且琯溪蜜柚胚囊中有强烈的亮点出现。说明子房是两品种自交不亲和的主要区域，胚囊仍是琯溪蜜柚的抑制部位，导致了琯溪蜜柚的不正常受精。4、采用石蜡切片技术对琯溪蜜柚和度尾蜜柚自交和互交胚珠发育进行了比较观察。琯溪蜜柚的自交授粉后胚珠发育有两种不同情形（Ⅰ型和Ⅱ型），Ⅰ型在授粉后5d的珠心组织细胞有变形现象，接着胚囊萎缩，但外珠被能生长发育到50d左右；Ⅱ型受精后胚乳发育异常，种子不能发育。度尾蜜柚自交胚囊中胚乳没有出现，在授粉后35d左右珠心组织和囊腔同时萎缩。互交胚珠发育正常，成熟果实有籽。表明两品种是自交不亲和的，导致了果实无籽。但两者的识别反应和阻抑部位不同，琯溪蜜柚Ⅰ型可能出现在受精前，Ⅱ型出现在受精后，而度尾蜜柚自交花粉管可能没有进入胚囊，是一种受精前的障碍。瘪籽的大小与不亲和障碍发生的时期有关。5、为了在琯溪蜜柚中发掘自交不亲和性相关基因，通过抑制差减杂交（SSH）的方法，以自交后的雌蕊的cDNA为tester，花粉为driver，建立了一个差减cDNA文库。选定80个克隆进行测序，结果42个克隆测序成功，即得到42个独立的（unique）ESTs序列。42个ESTs通过Blast比较分析，发现有23个ESTs与已知的genebank中mRNA序列有很高的同源性，并由此分为16个功能组，其中有4个与已经报道的与自交不亲和有关的基因：钙依赖蛋白激酶（CDPK，CGDH2035）、磷酸酶（CGDF107）、肌醇—磷酸合成酶（CGF2030、CGF2011）、GTP酶结合蛋白（CGS10601）。除此之外，从差减文库中还获得一些未知基因。所以，下一步的工作就是要鉴定那些基因是与柚自交不亲和性有关，并克隆这些cDNA的全长基因，这不仅对于我们了解柚自交不亲和性反应的机制，还是对于进一步的基因操作以调控自交不亲和的发生都具有非常重要的意义。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词
• 引言
• 文献综述
• 1.自交不亲和性
• 1.1 孢子体自交不亲和性的研究进展
• 1.2 配子体自交不亲和性的研究进展
• 1.2.1.以S-RNase为基础的SI信号转导
• 1.2.1.1.S-RNase——SI信号分子
• 1.2.1.2.花粉S蛋白——信号分子的受体
• 1.2.1.3.细胞信号转导途径
• 1.2.2.罂粟科自交不亲和性
• 1.2.2.1.柱头S蛋白——信号分子
• 1.2.2.2.花粉S受体—信号接受体
• 1.2.2.3.信号转导
• 1.3.禾本科植物自交不亲和机理
• 1.4、配子体SI信号转导存在的问题及展望
• 2.抑制性扣除杂交技术
• 2.1 SSH技术的基本原理及过程
• 2.2 对SSH技术的评价
• 2.3 SSH在相关基因中的应用
• 2.4 SSH技术的进展
• 本研究目的与意义
• 实验方案
• 技术路线
• 第一章 琯溪蜜柚和度尾蜜柚自交和异交亲和性观察
• 1.材料与方法
• 1.1.供试材料
• 1.2.授粉试验和采样时期
• 1.3.研究方法
• 2.结果与分析
• 2.1.自交和异交花粉在柱头上的萌发行为
• 2.2.自交和异交花粉管从柱头组织进入花柱道中的生长行为
• 2.3.自交和异交花粉管沿花柱道的生长行为
• 2.4.自交和异交花粉管在子房中的生长行为
• 2.5.自交和异交花粉管在胚珠中的生长行为
• 3.讨论
• 第二章 雌蕊不同部位抽提液对花粉萌发的影响
• 1.材料与方法
• 1.1.供试材料
• 1.2.实验方案
• 1.3.方法
• 1.3.1 花粉收集
• 1.3.2 抽提液的提取
• 1.3.3 播花粉
• 1.3.4 花粉萌发率、花粉管弯曲率和长度统计
• 2.结果与分析
• 2.1.柱头抽提液对花粉萌发和花粉管生长行为的影响
• 2.2.花柱抽提液对花粉萌发和花粉管生长行为的影响
• 2.3.子房抽提液对花粉萌发和花粉管生长行为的影响
• 3.讨论
• 第三章 花粉在雌蕊不同部位组织的亲和性观察
• 1.材料与方法
• 1.1.供试材料
• 1.2.授粉组合设计
• 1.3.荧光观察
• 2.结果与分析
• 2.1.花粉在短截柱头上的萌发行为
• 2.2.花粉在短截花柱的萌发行为
• 2.3.花粉在短截子房中的萌发行为
• 2.4.花粉管在胚珠中的行为
• 3.讨论
• 第四章 琯溪蜜柚和度尾蜜柚自交和互交胚珠发育状况的比较
• 1.材料与方法
• 1.1 供试品种
• 1.2 授粉试验
• 1.3 采样时期
• 1.4 石蜡切片
• 1.5 解剖观察
• 2.观察结果
• 2.1 授粉后5d胚珠的发育状况
• 2.2 授粉后20d胚珠的发育状况
• 2.3 授粉后35d胚珠的发育状况
• 2.4 授粉后50d胚珠的发育状况
• 2.5 授粉后65d胚珠的发育状况
• 3.讨论
• 第五章 琯溪蜜柚自交不亲和相关基因的克隆与分析
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 供试品种
• 1.1.2 材料培养与处理
• 1.1.3 实验试剂及测序
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 总RNA的提取和纯化
• 1.2.1.1 实验准备
• 1.2.1.2 实验程序
• 1.2.2 从总RNA中分离mRNA
• 1.2.2.1 实验准备
• 1.2.2.2 实验程序
• 1.2.3 抑制差减杂交
• 1.2.4 正向差减cDNA的克隆
• 1.2.5 差异筛选cDNA文库
• 1.2.6 阳性克隆的测序和序列分析
• 2.结果与分析
• 2.1 RNA的提取及纯化
• 2.2 差减cDNA文库的构建
• 2.4 阳性克隆的测序及序列分析
• 3.讨论
• 结论
• 参考文献
• 博士期间发表的论文
• 致谢