单环刺螠纤溶酶UFEⅠ的分离纯化和性质研究

论文摘要

血栓性疾病是严重危害人类健康的常见多发病,心脑血管疾病中有很大比例本质为血栓病,它主要危害心、脑、肺等的血管系统,造成成年人死亡或残疾。在我国,每年有超过260万人死于心脑血管疾病,每年需要进行溶栓治疗的病人超过300万人,并且,这类疾病的发病率曾逐年上升趋势。纤溶疗法是治疗血栓性疾病的主要手段之一,迄今溶栓药物已发展了三代,但距理想的溶栓药物尚有差距。寻找和开发新型溶栓剂仍是心脑血管疾病治疗的重要内容。鉴于海洋生物活性物质具有独特的优点,海洋生物日益成为新药开发的珍贵资源。本实验室经多年研究,从海洋无脊椎动物单环刺螠中寻找和分离了一种新型纤溶酶。现将主要研究结果分述如下:单环刺螠纤溶酶在单环刺螠体腔液及内脏等组织内含量丰富,经优化工艺可提取多种酶活力组分,很可能是一组同工酶。我们试用两套工艺均能制得单环刺螠纤溶酶UFEⅠ,达电泳纯,经过提取分离纯化工艺的酶纯化倍数可达11-12倍,产品酶得率可达27.0-30.0%。单环刺螠纤溶酶经Native-PAGE电泳分析,该酶纯度已经达到99%;经SDS-PAGE和飞行质谱测定其分子量约为23,800Da;糖含量测定表明,该酶不是一种糖蛋白。单环刺螠纤溶酶,在45℃以下时酶活力稳定,6 h内酶的活性基本保持不变;在10种不同pH（3、4、5、6、7、8、9、10、11）的缓冲液中于室温下放置24 h,酶活无明显改变。单环刺螠纤溶酶的最适反应温度为45℃,最适pH约为6.5。Ag+离子对单环刺螠纤溶酶有抑制作用,Mn2+和Mg2+离子对酶有活化作用。其他金属离子。以酪蛋白为底物,根据双倒数作图法（Lineweaver-Burk plot）求出的酶反应的动力学常数为:Km=3.48×10-3mol·L-1,Vmax=1.20×10-2mol·L-1·min-1。单环刺螠纤溶酶对纤维蛋白具有很高的亲和性,不仅可以降解纤维蛋白,还具有较高的激酶活性,这使得该酶能够激活纤溶酶原并使之转化为纤溶酶,从而间接地溶解纤维蛋白。体外抗凝、溶栓实验结果表明:与蚓激酶相比,单环刺螠纤溶酶具有更好的抗凝作用和溶栓效果,而且对血红细胞损伤较小。综上所述,由于单环刺螠纤溶酶分子量小、酶活性稳定、溶栓活性强、对血红细胞损伤小等优点,做为溶栓剂具有潜在的应用开发价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1 血栓性疾病概述
• 1.1 血栓性疾病危害与类型
• 1.2 凝血和抗凝的基本原理
• 1.2.1 凝血系统
• 1.2.2 抗凝系统
• 1.2.3 纤溶系统
• 1.2.3-1 纤溶系统的组成
• 1.2.3-2 纤维蛋白降解过程及其调控
• 1.3 血栓性疾病的治疗
• 1.4 治疗血栓性疾病的药物
• 1.4.1 抗凝血药物
• 1.4.2 抗血小板药物
• 1.4.3 溶栓药
• 1.4.3-1 第一代溶栓药
• 1.4.3-2 第二代溶栓药
• 1.4.3-3 第三代溶栓药
• 1.4.4 现有溶栓药的作用途径
• 1.4.5 抗血栓的中草药
• 1.5 临床常用纤溶酶与具有临床应用前景的纤溶酶
• 1.5.1 动物来源纤溶酶
• 1.5.2 微生物来源纤溶酶
• 1.5.2-1 葡激酶（staphylokinase,SAK）
• 1.5.2-2 纳豆激酶（nattokinase,NK）
• 1.5.2-3 根霉（Rhizopus chinensis）12#
• 1.6 海洋生物来源的心脑血管药物及活性物质
• 1.6.1 海洋生物多糖类及其衍生物
• 1.6.2 海洋生物中蛋白及糖蛋白类
• 2 海洋无脊椎动物单环刺螠研究
• 2.1 生态习性及环境
• 2.2 形态解剖
• 2.3 分类与进化
• 2.4 营养
• 2.5 生物活性物质
• 2.6 单环刺螠的潜在开发价值与未来展望
• 3 立论依据
• 3.1 选题依据与背景情况
• 3.2 课题研究的目的与意义
• 第二章 单环刺螠纤溶酶UFEI的筛选与分离纯化
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料、试剂与仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 蛋白浓度测定:
• 2.2.2 以酪蛋白为底物Folin-酚试剂法测定酶活力:
• 2.2.2-1 Folin-酚试剂的制备:
• 2.2.2-2 标准曲线的制备
• 2.2.3 酶的纤溶活性确定:
• 2.2.4 统计学方法:
• 2.3 纤溶酶的制备工艺
• 2.3.1 工艺A
• 2.3.2 工艺B
• 3 结果
• 3.1 酶粗品的制备
• 3.2 酶的分离纯化
• 3.3 酶UFEIa的分离纯化收率
• 3.4 酶的纤溶活性确定:
• 4 讨论
• 5 小结
• 第三章 酶UFEIa的纯度鉴定和分子量测定
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 试剂与主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 纤溶酶组分纯度的测定:
• 2.2.2 SDS-PAGE电泳操作步骤:
• 2.2.3 分子量测定:
• 2.2.4 统计学方法:
• 3 结果
• 3.1 单环刺螠纤溶酶的非变性和变性凝胶电泳
• 3.2 质谱图谱
• 3.3 电泳后酶区带活性的检验
• 4 讨论
• 5 小结
• 第四章 单环刺螠纤溶酶的酶学性质研究
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 试剂与主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 温度对酶反应的影响（琼脂糖纤维蛋白平板法）
• 2.2.2 pH对酶反应的影响（琼脂糖纤维蛋白平板法）
• 2.2.3 金属离子对酶反应的影响（酪蛋白为底物Folin-酚试剂法）
• 2.2.4 底物浓度对酶反应速度的影响（以酪蛋白为底物Folin-酚试剂法）
• 2.2.5 激酶活力测定
• 2.2.5-1 平板制作
• 2.2.5-2 溶液配制
• 2.2.5-3 蛋白水解酶活性测定
• 2.2.5-4 激酶活性测定
• 2.2.5-5 样品效价计算
• 2.2.6 酶蛋白的糖含量测定（王秀奇等,1999）
• 2.2.7 统计学方法:
• 3 结果
• 3.1 温度对酶反应的影响
• 3.2 pH对酶反应的影响
• 3.2.1 以琼脂糖纤维蛋白平板法测得不同pH条件下酶的稳定性
• 3.2.2 酶的最适反应pH:
• 3.3 金属离子对酶反应的影响
• 3.4 底物浓度对酶反应速度的影响
• 3.5 酶的动力学常数
• 3.6 激酶活力测定结果
• 3.7 单环刺螠纤溶酶的糖含量
• 4 讨论
• ⅰ 单环刺螠纤溶酶作为溶栓剂的可能作用机制
• ⅱ 酶学性质的研究
• 5 小结
• 第五章 单环刺螠纤溶酶的体外抗凝和溶栓活性研究
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料与主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 蚓激酶的提取:
• 2.2.2 单环刺螠纤溶酶抗凝活性检测
• 2.2.3 UFEIa和EFE体外溶栓比较研究
• 2.2.4 统计学方法:
• 3 结果
• 3.1 酶的抗凝效果
• 3.2 酶对血红细胞形态和释放量的影响
• 3.3 两种酶不同浓度下水解血栓速度的比较
• 4 讨论
• 5 小结
• 总结
• 参考文献
• 致谢