青岛文昌鱼SAHH基因的鉴定、表达及进化分析

论文摘要

S-腺苷高半胱氨酸水解酶（SAHH）是细胞内广泛存在的一种酶,催化S-腺苷高半胱氨酸（AdoHcy）可逆水解生成腺苷（Ado）和高半胱氨酸（Hcy）,SAHH是调节胞内甲基化水平的重要酶。文昌鱼（Amphioxus）是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型,是研究脊椎动物进化的珍贵材料。本文从青岛文昌鱼（Branchiostomabelcheri tsingtaunese）肠cDNA文库中,克隆了具有完整编码框的SAHH基因（AmphiSAHH）,并对其结构、表达、进化及蛋白特性展开了研究。青岛文昌鱼SAHH基因包括一个1305bp的最大开放阅读框,编码434个氨基酸,推测其分子量为47.8kDa。同源分析比对发现,文昌鱼SAHH蛋白与其它物种SAHH蛋白的相似性高达67.3%—82.1%。在所建的进化树中,文昌鱼SAHH蛋白位于脊椎动物分枝的基部,脊椎动物和无脊椎动物各自聚群,支持了文昌鱼是脊椎动物起源的观点,也进一步证明AmphiSAHH是脊椎动物和无脊椎动物SAHH蛋白的同源物。原位杂交分析表明,AmphiSAHH在文昌鱼原肠胚内胚层开始表达,在神经胚及幼虫时期信号也在肠部出现,推测SAHH基因对文昌鱼发育过程中肠的形成有重要的作用。AmphiSAHH基因组DNA序列分析发现其具有八个外显子和七个内含子,分析各物种SAHH基因组DNA序列发现,海鞘（九个外显子与八个内含子）与脊椎动物（十个外显子和九个内含子）似乎有更近的亲源性。本文还利用实时定量技术检测了Ado对文昌鱼SAHH基因表达的影响。原核表达并纯化了文昌鱼His-SAHH重组蛋白,获得分子量约为48kDa的纯化蛋白。利用分光光度法和HPLC法检测重组蛋白的酶活及其与NAD+/NADH的结合系数。使用成品SAHH多克隆抗体进行Western杂交及免疫组化实验,结果表明,抗体能与我们的重组蛋白特异性杂交,SAHH蛋白主要分布在文昌鱼精巢、卵巢、肝盲囊及鳃裂。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.文昌鱼—发育生物学和进化生物学的模式生物
• 2.文昌鱼发育及分子生物学研究
• 2.1 文昌鱼功能基因的分类
• 2.2 文昌鱼部分发育相关基因的研究概况
• 3.S—腺苷高半胱氨酸水解酶研究进展
• 3.1 SAHH的发现
• 3.2 SAHH的生理功能
• 3.3 SAHH的基本结构
• 3.4 SAHH的晶体结构
• 3.5 基于SAHH晶体结构提出的催化机制
• 3.6 SAHH抑制剂的作用机制
• 4.本论文的主要内容及技术路线
• 第二章 青岛文昌鱼SAHH基因的特征、基因组结构及进化分析
• 1.前言
• 2.材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 青岛文昌鱼cDNA文库的构建与测序
• 2.2.2 序列比较与系统进化分析
• 2.2.3 文昌鱼SAHH基因组DNA的PCR扩增和序列分析
• 2.2.4 AmphiSAHH的空间结构分析
• 3.结果
• 3.1 文昌鱼SAHH cDNA的确定和序列分析
• 3.2 青岛文昌鱼SAHH蛋白的进化分析
• 3.3 文昌鱼SAHH基因在基因组DNA中的存在情况及分析
• 3.4 AmphiSAHH空间结构
• 4.讨论
• 第三章 青岛文昌鱼SAHH基因的表达及实时定量检测
• 1.前言
• 2.材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 Northern blot
• 2.2.2 文昌鱼胚胎SAHH基因的整体原位杂交
• 2.2.3 实时定量技术
• 3.结果
• 3.1 文昌鱼SAHH基因Northern杂交
• 3.2 整体原位杂交技术检测SAHH基因在文昌鱼不同发育时期的时空表达
• 3.3 实时定量检测结果
• 4.讨论
• 第四章 青岛文昌鱼SAHH蛋白的融合表达、纯化、鉴定及特性分析
• 1.前言
• 2.材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 表达载体的构建
• 2.2.2 含pET-28-SAHH的表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）中的诱导表达
• 2.2.3 重组His-SAHH融合蛋白的纯化
• +/NADH结合系统测定'>2.2.4 重组His-SAHH融合蛋白的酶活及NAD⁺/NADH结合系统测定
• 2.2.5 重组His-SAHH融合蛋白的Western blot检测
• 2.2.6 文昌鱼SAHH蛋白的免疫组织化学检测
• 3.结果
• 3.1 pET-28-SAHH表达载体的构建
• 3.2 重组质粒pET-28-SAHH在大肠杆菌中的表达
• 3.3 重组His-SAHH融合蛋白的纯化
• +/NADH结合系统'>3.4 重组His-SAHH融合蛋白的酶活及NAD⁺/NADH结合系统
• 3.5 SAHH蛋白的Western blot检测
• 3.6 文昌鱼SAHH蛋白的免疫组织化学分析
• 4.讨论
• 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录