论文摘要
目的确证胰岛素能够促进钙化型血管平滑肌细胞(CVSMCs)向成骨细胞分化及CVSMCs的钙化,并研究其作用机制。方法取6周雄性大鼠处死,取主动脉,分离出CVSMCs,被单克隆抗体a-actin染色并能表达碱性磷酸酶(ALP)形成钙化结节的细胞确定为CVSMCs。通过分光光度计测量溶液中的p-硝基苯酚以测定ALP活性,用放射免疫分析试剂盒测定溶液中骨钙素(OC)含量。通过干预组与对照组比较,观察胰岛素刺激CVSMCs中NF-κB受体活化因子配体(RANKL)表达的剂量效应;采用实时定量PCR检测(?)mRNA的表达。通过茜素红S染色确定矿化基质的范围。为阐明RANKL,细胞外信号调节激酶(ERK 1/2)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt信号通路是否以及如何介导CVSMCs向成骨细胞分化,我们应用小干扰RNA(siRNA)干预RANKL表达,分别用信号通路阻断剂(PD98059、LY294002或HIMO)预处理CVSMCs阻断ERK 1/2和PI3K/Akt信号通路,然后观察CVSMCs中RANKL的表达及ALP的活性。CVSMCs中ERK1/2、Akt活性及其磷酸化水平p-ERK1/2、p-Akt采用Western blot分析法检测。结果实验证明胰岛素能够增强CVSMCs中ALP,OC表达及钙化结节的形成。胰岛素可呈剂量依赖性方式诱导CVSMCs中RANKL的表达。通过siRNA抑制RANKL的表达可降低胰岛素诱导的ALP的活化。胰岛素促进ERK1/2 MAPK和Akt的活化。用ERK信号通路阻断剂PD98059对CVSMCs进行预处理,抑制了由胰岛素诱导的CVSMCs向成骨细胞的分化,p38和JNK抑制剂无此效应。结论本研究表明胰岛素通过诱导ERK1/2细胞信号通路活化增加RANKL的表达促使CVSMCs向成骨细胞分化,而对PI3K/Akt细胞信号通路并未激活。
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