论文摘要
红系特异的5-氨基酮戊酸合成酶（ALAS2）是红系细胞血红素生物合成的限速酶。ALAS2的缺失能导致红细胞发育的停滞,ALAS2基因的遗传性突变能引起X-连锁的成高铁红细胞贫血（XLSA）。ALAS2基因的表达在红细胞发生过程中显著增加以满足血红蛋白合成增加时对更多血红素的需求。ALAS2基因的表达主要在转录水平和翻译水平被调控。本论文用组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠和TSA处理红白血病细胞K562,反转录-PCR（RT-PCR）和染色质免疫沉淀（ChIP）分析发现细胞内ALAS2基因转录水平明显升高,同时伴随着ALAS2基因启动子组蛋白H4乙酰化水平的升高。ChIP实验进一步表明组蛋白乙酰转移酶p300能够与ALAS2基因启动子结合。细胞转染和报告基因分析结果显示:p300在细胞内过量表达既能提高ALAS2基因启动子报告基因的转录活性,又能提高细胞内源ALAS2基因mRNA水平。用p300的突变体p300ΔHAT（乙酰转移酶催化结构域缺失）代替p300重复上述实验发现p300乙酰转移酶活性在激活ALAS2基因转录过程中是必要的。另外,我们还通过电泳迁移率（EMSA）实验确定ALAS2基因启动子上两个新的Sp1结合位点。报告基因染色质免疫沉淀（reporter ChIP）实验结果显示:p300和GATA-1共转染细胞使ALAS2野生型基因启动子处的组蛋白H4乙酰化水平升高,对GATA-1位点突变的启动子组蛋白乙酰化水平无明显影响。位点突变体报告基因分析表明ALAS2基因启动子上的两个GATA-1位点和所有的Sp1位点都参与了p300的招募。我们的工作确定了ALAS2基因是组蛋白乙酰转移酶p300/CBP的一个靶基因。另一方面,我们研究了组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠（NaBu）激活ALAS2基因转录的机制。我们发现NaBu不仅能上调红系细胞ALAS2基因的转录,而且能激活非红系细胞ALAS2基因的转录。同时ALAS2基因启动子的组蛋白H3乙酰化水平以及组蛋白H3的第4位赖氨酸的双甲基化水平升高。以启动子报告基因质粒转染细胞,然后用含有NaBu的培养基培养细胞,结果表明NaBu能以剂量依赖的方式增强ALAS2基因启动子转录活性。以各种位点突变体报告基因质粒转染细胞,再用NaBu处理发现,任何一个Sp1位点的突变都会不同程度地降低NaBu对ALAS2基因启动子的激活作用,当所有的Sp1位点都突变时, NaBu对ALAS2基因启动子的激活作用大大降低。因此,我们相信ALAS2基因启动子上的Sp1位点是NaBu的应答元件,即Sp1位点至少部分地介导了NaBu对ALAS2基因转录的激活。染色质免疫沉淀实验还发现NaBu的处理能增加ALAS2基因启动子上Sp1因子的结合。进一步研究发现:组蛋白去乙酰化酶HDAC1能抑制ALAS2基因启动子的活性,它还能逆转Sp1和p300对ALAS2基因启动子的协同激活作用。ChIP实验证实了ALAS2基因启动子上有HDAC1的结合,免疫共沉淀（CoIP）分析表明Sp1和HDAC1存在于同一复合物中。因此,我们认为转录因子Sp1能招募去乙酰化酶HDAC1抑制ALAS2基因的转录,推测HDAC抑制剂NaBu通过抑制HDAC1的活性促进ALAS2基因的转录。
论文目录
中文摘要英文摘要第一章 文献综述一、组蛋白修饰和组蛋白密码（一） 组蛋白修饰酶（二） 复杂的组蛋白密码（三） 解读“组蛋白密码”二、p300/ CBP 及其在造血系统基因转录调控中的作用（一） p300/CBP 的结构（二） p300/CBP 基因与疾病（三） p300/CBP 的作用机制（四） p300/ CBP 在造血系统基因转录调控中的作用（五） p300/ CBP 在造血系统基因转录调控中的作用机制三、红系特异的5-氨基酮戊酸合成酶（ALAS2）基因的表达调控研究进展（一） 动物血红素合成的途径（二） 红细胞发生过程中 ALAS2 基因的表达（三） 血红素在红细胞分化中的作用（四） 调控 ALAS2 基因表达的转录因子（五） 人类 ALAS2 基因内含子中红系特异的增强子的鉴定（六） 在红系细胞分化后期 ALAS2 基因是如何被激活的（七） Fe 对ALAS2 基因翻译的调控（八） 血红素对 ALAS2 基因表达的负调控（九） ALAS2在X-连锁的成高铁红细胞贫血（XLSA）中的作用第二章 引言一、本论文的研究背景和立题依据（一） ALAS2 基因简介及研究背景（二） 立题依据二、本论文的研究内容和意义第三章 实验材料与方法一、实验材料（一） 细胞（二） 质粒（三）主要试剂及仪器设备二、实验方法（一） 细胞培养和去乙酰化酶抑制剂处理（二） 报告基因质粒的构建（三） 质粒的大量制备（四） 磷酸钙瞬时转染（五） 脂质体转染（六） 荧光素酶双报告检测（七） 逆转录-PCR、实时定量PCR（RT-PCR 、Real-time PCR）（八） 免疫荧光（九） 电泳迁移率分析（EMSA）（十） 蛋白质电泳和免疫印迹（Western blotting）（十一） 蛋白质免疫共沉淀（CoIP）（十二） 染色质免疫沉淀（ChIP）第四章 实验结果与分析一、组蛋白乙酰转移酶p300 对人红系特异的5-氨基酮戊酸合成酶（ALAS2）基因转录的调控（一） 组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂NaBu 和TSA 刺激K562 细胞ALS52 mRNA 水平升高，同时 NaBu 能升高 ALAS2 基因启动子组蛋白 H4 的乙酰化水平（二） p300过表达增强ALAS2基因启动子的转录活性（三） ALAS2 基因启动子上有p300蛋白的结合，过表达p300能升高细胞内源ALAS2 基因的mRNA水平（四） ALAS2基因启动子上的两个Sp1结合位点被确认（五） p300和红系转录因子GATA-1协同激活ALAS2基因启动子转录，ALAS2 基因启动子上两个GATA-1位点对于p300的功能都是必要的（六） p300 与转录因子GATA-1 和Sp1 协同增强ALAS2 基因启动子的转录活性二、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂丁酸钠（NaBu）激活红系5-氨基酮戊酸合成酶（ALAS2）基因转录的机制（一） 组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠激活非红系细胞中 ALAS2 基因转录，伴随着ALAS2 基因启动子组蛋白H3 乙酰化水平和H3-Ly54 的双甲基化水平的升高（二） HDAC 抑制剂NaBu 上调ALAS2 基因启动子的转录活性（三） HDAC抑制剂NaBu至少部分地通过ALAS2基因启动子上的Sp1位点调控ALAS2基因的转录（四） NaBu处理细胞使内源ALAS2基因启动子上Sp1蛋白结合增加（五） 组蛋白去乙酰化酶HDAC1 抑制ALAS2 基因启动子转录活性（六） HDAC1与ALAS2基因启动子结合（七）HDAC1与Sp1存在于同一复合物中第五章 讨论一、组蛋白乙酰转移酶 p300/CBP 参与 ALAS2 基因转录（一）组蛋白乙酰化和 p300/CBP 参与 ALAS2 基因转录（二）组蛋白乙酰转移酶 p300/CBP 的招募及其作用机制二、组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠（sodium butyrate, NaBu）上调 ALAS2 基因的表达（一）丁酸钠（NaBu）通过 ALAS2 基因启动子的 Sp1 位点调控 ALAS2 基因的表达（二）丁酸钠（NaBu）通过抑制 HDAC1 的去乙酰化酶活性而激活 ALAS2 基因的转录三、组蛋白乙酰转移酶 p300/CBP 和组蛋白去乙酰化酶 HDAC1 对 ALAS2 基因的转录调控主要结论和创新点参考文献附录作者简介在学期间公开发表论文及著作情况致谢
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标签：转录调控论文; 组蛋白乙酰化论文; 组蛋白去乙酰化论文;
组蛋白乙酰转移酶p300在ALAS2基因转录调控中的作用及组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠激活ALAS2基因转录的机制
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