小麦成熟胚脱分化过程的DNA甲基化研究

论文摘要

为研究小麦成熟胚脱分化过程的DNA甲基化的变化情况,本试验利用了基因芯片技术分析相关基因的表达情况和HPLC法测定了基因组中5-甲基胞嘧啶的百分含量以及采用MSAP标记筛选出DNA甲基化发生变化的位点,进而探讨小麦成熟胚DNA甲基化在脱分化过程的变化规律,最终了解DNA甲基化在小麦脱分化过程中的作用。主要结果如下:1.利用基因芯片技术研究了小麦成熟胚脱分化过程中的有关DNA甲基化及组蛋白修饰相关基因的表达变化情况,确定了脱分化过程的一些重要基因利用Affymetrix wheat GeneChip?研究了小麦成熟胚脱分化过程（0、2、6、12、24和72 h）中DNA甲基化及组蛋白修饰相关基因的表达变化情况,结果表明,与DNA甲基化和组蛋白修饰有关的基因有36个。这36个基因中有16个至少在小麦脱分化过程中有一个时点发生了有意义表达变化。CA500212等9个基因表达上调,CD373978等6个基因表达下调,只有BJ301005在有的时点表达上调,有的时点表达下调)（简称上/下调表达）。其中,信号传导期（0-2 h）有BJ213871等3个基因起始上调,CD373978和CD912490共2个基因起始下调;信号响应期（2-12 h）有CA500212等8个基因起始上调,CD373978等5个基因起始下调;细胞重塑期（12-24 h）有BQ166624和BJ308556共2个基因起始上调,BQ161896和CA600655共2个基因起始下调;愈伤组织形成期（24-72 h）只有1个基因BQ162603起始上调,BQ161896和CA600655共2个基因起始下调;小麦成熟胚脱分化过程中DNA甲基化和组蛋白修饰相关基因表达的总体情况是:共表达上调44次,下调23次。其中,信号传导期有基因上调3次,下调2次;信号响应期有基因上调18次,下调9次;细胞重塑期有基因上调12次,下调7次;愈伤组织形成期有基因上调12次,下调5次。其上调范围为对照的2-34倍,下调范围为对照的2-17倍。2.利用高效液相色谱法测定小麦成熟胚脱分化过程的5-甲基胞嘧啶百分含量,并与无2,4-D诱导的相应时点的小麦成熟胚的5-甲基胞嘧啶百分含量进行了比较结果表明,小麦成熟胚脱分化过程中在0 h时5-甲基胞嘧啶的百分含量为21.53%,在含有2,4-D的培养基上培养2 h后降低到2.75%,随着培养时间的延续,又逐渐升高,到12 h时达到最高（24.30%）,随后又逐渐降低（72 h时为14.97%）。与无2,4-D诱导的相应时点的小麦成熟胚相比,它们表现出在0-2 h骤然降低和24-72 h明显下降。3.小麦成熟胚脱分化过程中的MSAP分析试验采用了MSAP法对小麦成熟胚脱分化过程DNA甲基化的变化位点进行了研究。结果表明,在12对引物组合中有4对引物组合产生了多态性,共产生了23个多态性位点。选择性扩增结果表明,由于MspⅠ,HpaⅡ/EcoRI酶切组合能清晰分辨DNA甲基化的变化,所以带的多态性代表着DNA甲基化的变化。根据带的出现或消失可以将这些带分为四类:第一类为逐渐出现,这些位点发生了C5mCGG的半甲基化;第二类为逐渐消失,这些位点发生了C5mCGG序列的全甲基化或5mCCGG的半甲基化;第三类为出现后又消失,其位点发生了5mCCGG的半甲基化;第四类为出现后消失最后又出现,其位点先发生了C5mCGG序列的全甲基化,随后在2-6 h没有发生甲基化,而在24-72 h又发生了C5mCGG的半甲基化。从整体上看,整个脱分化过程中表现出了一种动态变化。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 DNA 甲基化及其特点
• 1.2 DNA 甲基化的生物学意义
• 1.2.1 保护本身基因组免遭破坏
• 1.2.2 为植物正常生长发育所必需
• 1.2.3 与植物的春化作用及开花有关
• 1.2.4 DNA 甲基化与转基因植株的基因沉默
• 1.2.5 可调节植物内源基因的表达
• 1.2.6 DNA 甲基化与杂种优势
• 1.2.7 DNA 甲基化与植物组织培养及体细胞无性系变异
• 1.3 DNA 甲基化模式产生及维持机制
• 1.3.1 DNA 甲基化的模式
• 1.3.1.1 DNA 甲基转移酶或DNA 甲基化酶
• 1.3.1.2 去甲基化作用
• 1.3.1.3 De novo 甲基化信号
• 1.3.2 DNA 甲基化抑制基因转录的机理
• 1.3.2.1 甲基化引起转录抑制的假说
• 1.3.2.2 MBD 与转录抑制
• 1.3.3 DNA 甲基化调控基因转录的方式
• 1.3.3.1 DNA 甲基化与植物转座子活性
• 1.3.3.2 DNA 甲基化与DNA 甲基化不足
• 1.3.3.3 DNA 甲基化酶基因对反义转化植物的调控
• 1.4 DNA 甲基化研究方法
• 1.4.1 DNA 甲基化特异性分析
• 1.4.1.1 基于重亚硫酸盐处理的DNA 甲基化的分析技术
• 1.4.1.2 不依赖重亚硫酸盐处理的DNA 甲基化的分析技术
• 1.4.2 DNA 甲基化非特异性分析
• 1.4.3 DNA 甲基化相关基因的筛选及新的甲基化位点寻找技术
• 2 引言
• 2.1 立题依据
• 2.2 研究思路
• 2.3 技术路线
• 3 材料与方法
• 3.1 小麦成熟胚脱分化过程中DNA甲基化和组蛋白修饰相关基因的表达分析
• 3.1.1 实验系统和试剂
• 3.1.1.1 Affymetrix GeneChip?系统
• 3.1.1.2 试剂（Miscellaneous Reagent）
• 3.1.1.3 试剂配制
• 3.1.2 材料制备
• 3.1.3 Affymetrix 表达谱芯片实验操作
• 3.1.3.1 总RNA 的提取和纯化
• 3.1.3.2 cDNA 的合成和纯化
• 3.1.3.3 cRNA 的合成和纯化
• 3.1.3.4 cRNA 片段化、配制杂交液
• 3.1.3.5 芯片杂交
• 3.1.3.6 洗脱芯片
• 3.1.3.7 扫描芯片
• 3.1.3.8 数据分析
• 3.1.3.9 成熟胚脱分化过程DNA 甲基化和组蛋白修饰相关基因的确认
• 3.2 小麦成熟胚脱分化过程中不同时点5-甲基胞嘧啶的百分含量
• 3.2.1 材料准备
• 3.2.2 DNA 进行提取、纯度检测
• 3.2.3 基因组DNA 甲基化水平测定
• 3.3 小麦成熟胚脱分化过程的MSAP 分析
• 3.3.1 实验材料
• 3.3.2 主要实验试剂
• 3.3.3 实验方法
• 3.3.4 DNA 扩增反应
• 3.3.5 选择性扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
• 3.3.5.1 溶液的配制
• 3.3.5.2 制胶
• 3.3.5.3 电泳
• 3.3.5.4 固定、银染、显色
• 3.3.6 多态性带的回收，测序及序列分析
• 4 结果与分析
• 4.1 小麦成熟胚脱分化过程中DNA 甲基化相关基因分析
• 4.1.1 小麦成熟胚脱分化过程中DNA 甲基化和组蛋白修饰相关基因
• 4.1.2 小麦成熟胚脱分化过程中不同时点DNA 甲基化和组蛋白修饰相关基因表达数目变化
• 4.1.3 小麦成熟胚脱分化过程中不同时点DNA 甲基化和组蛋白修饰相关基因表达强度变化
• 4.2 小麦成熟胚脱分化和发芽过程的不同时点5-甲基胞嘧啶的百分含量
• 4.3 小麦成熟胚脱分化过程中的MSAP 分析
• 4.3.1 小麦成熟胚脱分化过程中的预扩增结果
• 4.3.2 小麦成熟胚脱分化过程中的选择性扩增结果
• 4.3.3 多态性带的回收，测序及序列分析
• 5 讨论
• 5.1 利用基因芯片技术研究了小麦成熟胚脱分化过程中基因表达的变化情况，确定了脱分化过程的一些重要基因
• 5.2 HPLC 法测定小麦成熟胚脱分化和发芽过程的5-甲基胞嘧啶的百分含量
• 5.3 MSAP 是一种较为有效的检测DNA 甲基化的方法
• 参考文献
• ABSTRACT
• 附录