Genetic Transformation of Wheat for Salt Tolerance

论文题目: Genetic Transformation of Wheat for Salt Tolerance

论文类型: 博士论文

论文专业: 作物遗传育种

文献来源: 河北农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 小麦(Triticum aestivm)是最为主要的粮食作物。随着世界人口的剧烈膨胀,所需粮食不断增加,这就需要对作物进行不断的遗传改良,在有限的可利用土地资源上生产出更多的粮食。在品种改良方面,转基因技术是传统育种方法最有前途的补充。在不影响现有优良品种的主要经济性状的前提下,转基因技术可以实现精确的遗传改造。目前,通过遗传工程手段可以使作物在逆境条件下旺盛生长。BADH是甜菜碱乙醛脱氢酶的编码基因,该酶是甜菜碱生物合成的一种关键酶,甜菜碱通过渗透调节发挥抗逆作用。植物体内BADH基因的表达,可以提高植物的抗盐能力。本研究通过基因枪和农杆菌介导法对小麦实施了遗传转化,目的是将BADH基因整合到小麦基因组中,以改善其抗盐能力。此外,还进行了小麦生长点遗传转化的初步研究,试图找到一种不需要愈伤组织培养、不受基因型限制的转化方法。 在本研究中,遗传转化对象是目前生产上广泛种植的冬小麦品种石4185。质粒pABH9用于基因枪(PDS-1000/He)转化由幼胚诱导的愈伤组织,该质粒含有ubiquitine启动子和nos终止子控制的BADH基因和bar基因(phosphinothricin acetyl transferase)。在转化过程中,在MS固体培养基内分别添加1、3、5 mg/l PPT(phosphinothricin)和/或100、150 mM NaCl作为转化筛选剂。总DNA从再生苗叶片中提取,用PCR方法检测BADH基因的整合情况。bar基因的表达通过叶片涂抹法检测,即将3 mg/l PPT溶液(含0.1%Tween20)涂抹在再生苗叶片上,观察叶片的褪绿情况。最后,将PCR阳性植株移栽到含0.5%NaCl的土壤中以评价其抗盐性。 本试验共轰击愈伤组织3263块,有15.99%的愈伤块较块增殖,将其置于再生培养基上诱导植株再生,大约9%的愈伤分化出植株。PCR检测表明,只有5株为BADH基因阳性,大约90%植株为阴性。PPT叶片涂抹试验与PCR结果相符。PCR阳性植株可在含0.5%NaCl的土壤中生长,而对照植株不能成活。若以轰击的愈伤组织数为基数计算,净转化率为0.15%。在本试验中,再生困难是关键问题,抗性筛选也不很有效。虽然获得了抗盐转基因小麦,但该法既费力又费钱,效率还不高。基因型的可组织培养性限制了转化效率。 用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL1介导法也进行了遗传转化。转化的基因为CaMV 35S启动子和nos终止子控制的BADH基因和nptⅡ基因(neomycin phosphotransferase),转化受体是由成熟胚和幼胚诱导的愈伤组织。在侵染和共培养阶段附加10G μM乙酰丁香酮,在含100 mM或150 mM NaCl的MS培养基上进行抗性愈伤筛选,在含100 mM NaCl的MS培养基上再生植株。对于那些经过8-10个星期仍不能诱导出胚芽的愈伤,在培养基中添加了亚精胺(spermidine)以诱导出芽。用PCR法检测再生植株中BADH基因的转化情况,在含0.5%NaCl的土壤中评价植株的抗盐性。 在共计侵染的4901块愈伤中,从中筛选出12%生长良好的愈伤。经分化诱导处理,有4.43%愈伤再生出植株。PCR检测证明,19.23%的再生植株表现为

论文目录:

ACKNOWLEDGEMENTS

Preface

List of Tables

List of Figures

1- INTRODUCTION

2- LITERATURE REVIEW

2.1 Genetic Transformation of Wheat

2.2 Genetic Engineering of Wheat for Abiotic Stresses

2.3 Transformation Methods Used for Wheat

2.3.1 Direct Methods

2.3.1.1 Simple direct methods

2.3.1.2 Bilolistic/microprojectile bombardment

2.3.2 Indirect Methods

2.3.2.1 Agrobacterium-Mediated Transformation

2.3.2.2 Agrobacterium-Mediated inplanta Transformation

2.4 Genetic Markers

2.4.1 Scorable/Screenable Markers

2.4.2 Selectable Markers

2.4.2.1 Antibiotic Resistance Markers

2.4.2.2 Herbicide Resistance Markers

2.4.2.3 Metabolic/Auxotrophic Marker Genes

2.5 Promoters

3 GENE GUN TRANSFORMATION OF WHEAT

3.1 MATERIALS AND METHODS

3.1.1 Callus Induction

3.1.2 Osmotic Treatment

3.1.3 Plasmid Vector

3.1.4 Extraction of Plasmid DNA

3.1.5 Preparing Micro-carriers

3.1.6 Coating plasmid DNA onto Micro-Carriers

3.1.7 Bombardment of Callus

3.1.8 Selection and regeneration

3.1.9 Extraction of genomic DNA from leaves

3.1.10 PCR (Polymerase Chain Reaction) Analysis

3.1.11 Phosphinothricin Leaf Paint Assay

3.1.12 Salt tolerance

3.2 RESULTS

3.2.1 Selection

3.2.2 Regeneration

3.2.3 Screening of Transformants

3.2.3.1 PCR test

3.2.3.2 PPT Leaf-painting

3.2.3.3 Salt tolerance

3.3 DISCUSSION

3.5 CONCLUSION

4 AGROBACTERIUM-MEDIATED TRANSFORMATION OF WHEAT

4.1 MATERIALS AND METHODS

4.1.1 Callus Induction

4.1.2 Agrobacterium Culture

4.1.3 Inoculation and co-cultivation

4.1.4 Selection and Regeneration

4.1.5 Molecular Characterization of Putative Transformants

4.1.6 Extraction of Plasmid DNA

4.1.7 Determination of osmotic stress resistance

4.2 RESULTS

4.2.1 Selection

4.2.2 Regeneration

4.2.3 PCR test for transformed status of plants

4.2.4 Salt tolerance of transformed plants

4.3 DISCUSSION

4.4 CONCLUSION

5 IN PLANTA APICAL MERISTEM TRANSFORMATION OF WHEAT

5.1 MATERIALS AND METHODS

5.1.1 Plant material, Inoculation, Co-cultivation and Selection

5.1.1.1 Transient GUS expression experiments

5.1.1.2 Transformation of apical meristem after germination

5.1.1.3 Transformation of apical meristem before germination

5.1.2. GUS Assay

5.1.3 Molecular Evaluation of Putative Transformants

5.2 RESULTS

5.2.1 Transient GUS expression

5.2.2 GUS expression in inflorescences from meristems inoculation after germination

5.2.3 GUS expression in inflorescences after inoculation of meristems before seed germination

5.2.4 PCR Analysis of T1 generation from GUS positive plants

5.2.5 Transformation of apical meristems with BADH and nptII

5.2.6 PCR test of kanamycim resistant plants

5.3 DISCUSSION

5.4 CONCLUSION

6 BADH TRANSGENE AND SALT TOLERANCE

7 SUMMARY

8 SUMMARY IN CHINESE

9 REFERENCES

发布时间: 2005-08-10

参考文献

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