论文摘要
研究背景miRNA属于调节RNA或核糖核酸调节子,miRNA在转录后水平调节特定靶基因mRNA的表达,从而参与生命过程中的一系列重要进程,甚至是肿瘤的发生。多个实验和临床分析证明miRNA可以调节癌基因和/或抑癌基因,从而发挥促癌或抑癌作用。很多国外及国内学者对miRNAs在肿瘤中的表达情况,及对肿瘤的发生、发展、分期、药物治疗和预后等方面开展了相关的研究工作。但是对胃癌中miRNAs的表达情况进行系统的研究还匮乏。我们前期工作是应用miRNA基因芯片（Illumina公司）分析7例经病理确诊为胃腺癌,以及及同个病人距离胃癌病灶5cm以上癌旁组织的miRNA表达。包括下列步骤:提取总RNA、RNA多聚腺苷酸化、双链cDNA合成与纯化、PCR扩增、芯片杂交及数据处理、并使用相关的数据分析软件,比较胃癌和癌旁组织中miRNAs的表达情况,芯片结果显示有9个miRNA差异表达（p<0.01）,其中6个在胃癌组织中高表达（hsa-miR-181a,hsa-miR-21,hsa-miR-21*,hsa-miR-27a,hsa-miR-584,hsa-miR-93）。目的前期研究中已发现胃癌组织存在差异性miRNA表达谱,本研究将扩大样本量,用定量RT-PCR验证芯片显示胃癌中高表达的4个miRNA表达情况;同时设立其他无胃癌患者且内镜诊断为慢性浅表性胃炎（CSG）者组成对照组,对比目标miRNA在胃癌、癌旁及CSG中表达情况;使用相关的数据分析软件预测其靶基因;为下一步研究该miRNA的靶基因及KEGG通路与胃癌的发生、发展和预后的相关性的研究奠定基础。方法1、从新鲜冰冻标本库中取出50对胃癌及癌旁标本,25例CSG活检标本提取总RNA,并逆转录成cDNA进行后续的实验。根据miRNA数据库和相关文献,查询人类miR-181a、miR-27a、miR-584和miR-93的序列,设计引物,应用LAN（锁核苷酸）引物SYBR GreenⅠ为染料的荧光定量PCR方法（Exiqon Universal）检测其在50对胃癌、距离胃癌病灶5cm以上的癌旁组织及CSG病人中的表达情况。2、为了明确差异表达的miRNAs与胃癌临床病理因素的关系,将已验证的miR-181a和miR-27a的表达水平与患者年龄、性别、病理分型以及有无淋巴结转移进行了统计分析。3、使用相关的数据分析软件（miRanda和Targetscans）预测miR-181a的靶基因,选择二个方法均预计的靶基因作为候选靶基因;采用KEGG通路数据库分析靶基因的KEGG通路。结果1、应用荧光定量PCR技术对50对胃癌及癌旁组织中miR-181a、miR-27a、miR-584、miR-93的表达情况进行验证。胃癌组织中miR-181a、miR-27a、miR-584和miR-93表达上调的例数分别为44（88%）、33（66%）、29（58%）和29例（58%）,配对样本的Wilcoxon符号秩检验显示,相对于癌旁组织,miR-181a及miR-27a在胃癌组织中均有统计学意义上的高表达（p<0.05）。同时运用两独立样本的Mann-Whitney秩和检验显示相对于慢性浅表性胃炎组织,miR-181a和miR-27a在胃癌组织中为高表达（p=0.00）。2、miR-181a和miR-27a的表达水平与胃癌患者年龄、性别、病理分型以及有无淋巴结转移均没有统计学差异。3、预测miR-181a和miR-27a对应的靶基因分别为61和45个,miR-181a和miR-27a靶基因分别参与了11及15个KEGG途径,包括了人类代谢途径、代谢作用、遗传信息处理、环境信息处理、细胞进程和有机体系等分子的相互作用和反应网络。结论1、通过应用荧光定量RT-PCR技术证实miR-181a和miR-27a在胃癌中为高表达。2、miR-181a和miR-27a的表达水平与患者年龄、性别、病理分型以及有无淋巴结转移均没有统计学差异。3、预测miR-181a和miR-27a的靶基因及KEGG通路。