β-葡聚糖酶的定向进化及热稳定性研究

论文摘要

β-葡聚糖酶是重要的工业用酶,可有效消除谷物β-葡聚糖在酿造和饲料工业中产生的负面影响。与国外相比,我国对β-葡聚糖酶的研究起步较晚,且研制的β-葡聚糖酶的热稳定性普遍较差,不能满足现代啤酒糖化工艺和颗粒饲料造粒的温度要求,因此提高β-葡聚糖酶的热稳定性具有非常重要的意义。本课题以大肠杆菌表达系统克隆和重组表达了β-葡聚糖酶基因;建立了高通量筛选耐热β-葡聚糖酶的方法;以克隆的β-葡聚糖酶基因为起始材料,通过设计的定向进化策略和建立的筛选手段提高野生型β-葡聚糖酶的热稳定性;检验所构建的热稳定性重组菌株的遗传稳定性;对热稳定性突变株EGs2的发酵条件进行优化;筛选并优化出提高β-葡聚糖酶热稳定性的复合保护剂;估算了热稳定性β-葡聚糖酶的储藏寿命。主要研究结果如下: 从Bacillus subtilis ZJF-1A5中克隆了大小为849bp的β-葡聚糖酶基因。通过序列比对,该基因编码的氨基酸序列与Borriss R、Sun,J和Hidetoshi发表的β-葡聚糖酶的氨基酸序列分别有1—3氨基酸的替换。β-葡聚糖酶基因经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后与用同样限制性内切酶切割的载体pET28a（+）进行重组表达,得到了27KD的有活性的β-葡聚糖酶。对酶在宿主细胞中的位置进行测定,结果显示:β-葡聚糖酶不仅分泌至细胞外,而且也存在于细胞内和周质空间。发酵上清液经硫酸氨盐析沉淀和DEAE Cellulose 52离子交换柱层析,纯化的β-葡聚糖酶经SDS-PAGE电泳鉴定,纯化产品为单一条带,分子量约27KD。纯化的β-葡聚糖酶的热学性质研究表明:β-葡聚糖酶的Tm值为62.5℃,最适反应温度为55℃。 本研究将定位膜转印和肉眼可见的平板筛选策略相结合,通过对影响菌落生长、酶的表达和转印成功率的各因素的优化,建立了高通量筛选耐高温β-葡聚糖酶的方法。结果显示:每个LB平板（直径90mm）用4μl 200mg/ml IPTG;IPTG要预先涂在LB平板上;菌落密度约为100个/平板;菌落培养时间为37℃,15小时;完全钝化野生型酶的条件为100℃ 2小时。对该方法的稳定性考察结果显示:该方法的重现性为100%,假阳性率为0.16%,假阴性率为12.22%。与其它高通量筛选方法相比,以滤膜为基础的高通量筛选方法存在许多优点,如透明圈清晰,假阳性率较低,筛选通量高,操作简便,费用低等。该方法作为一种固相酶筛选方法,在鉴别热稳定性和低温下催化活性同时得到提高的变异体时非常有效。 为了提高β-葡聚糖酶的热稳定性,利用体外定向进化技术对编码β-葡聚糖酶的基因进行改造。设计的定向进化策略包括一轮的随机突变和一轮的DNA改组。应用建立的高通量筛选方法筛选热稳定性突变体,最终获得EGs1和EGs2两株热稳定性突变体。通过对野生酶和突变酶的DNA序列和酶学性质分析发现:EGs1和EGs2分别有四个和五个氨基酸替换;这些氨基酸替换使EGs1和EGs2突变酶的Tm值分别比野生酶的Tm值（62.5℃）提高了3℃和5℃,达到了65.5℃和67.5℃;突变酶的最适反应温度也提高了5℃;两个突变酶对地衣多糖的水解能力分别被提高28%和降低21.6%;对地衣多糖的亲和力与野生型的一致,未见改变;在酶的最适pH值上,野生酶和EGs1突变酶为6.5,而EGs2突变酶为7.0;在酶的pH值稳定性方面,野生型和突变型β-葡聚糖酶都有较宽的pH稳定范围,在pH 6.0-8.5的范围内放置48h,β-葡聚糖酶仍保持80%以上的酶活力。这一结果说明了定向进化在提高酶的热稳定性方面是比较有效的。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 β-葡聚糖酶的研究概况
• 1.1 β-葡聚糖酶的分布
• 1.2 β-葡聚糖酶的酶学性质
• 1.3 β-葡聚糖酶的结构与功能研究
• 1.3.1 β-葡聚糖酶的三级结构和折叠
• 1.3.2 β-葡聚糖酶催化水解机理和催化氨基酸残基
• 1.4 β-葡聚糖酶的分子生物学研究
• 1.5 β-葡聚糖酶的蛋白质工程
• 1.5.1 杂合酶和热稳定性
• 1.5.2 循环重排
• 2 体外分子定向进化研究进展
• 2.1 体外分子定向进化的基本思路和策略
• 2.2 体外分子定向进化技术的演变和发展
• 2.2.1 以寡核苷酸为基础的最大随机化过程
• 2.2.2 整个基因的随机突变
• 2.2.3 依赖于序列同源的重组
• 2.2.4 不依赖于序列同源的重组
• 2.2.5 用计算机数值模拟进行定向进化
• 2.3 蛋白质进化方法的优、缺点
• 2.4 突变体文库筛选技术
• 2.5 体外分子定向进化的应用和发展前景
• 3 嗜热酶的研究进展
• 3.1 嗜热酶的生物化学和分子生物学特性
• 3.2 嗜热酶基因的克隆与表达
• 3.3 蛋白质的热稳定性机制
• 3.3.1 氨基酸组成及其内在倾向性对蛋白质热稳定性的影响
• 3.3.2 蛋白质分子内作用力对蛋白质热稳定性的影响
• 3.3.3 蛋白质构型对蛋白质热稳定性的影响
• 3.4 提高蛋白质稳定性的策略
• 3.4.1 蛋白质工程策略
• 3.4.2 计算机数值模拟方法
• 3.4.3 化学修饰法
• 3.4.4 保护剂的添加
• 4 选题背景及研究内容
• 第二章 枯草芽孢杆菌ZJF-1A5 B-葡聚糖酶基因的克隆与表达
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、质粒和酶
• 1.2 培养基
• 1.3 主要仪器和设备
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 引物的设计和合成
• 1.4.2 基因组提取
• 1.4.3 β-葡聚糖酶基因的扩增
• 1.4.4 PCR产物的纯化和回收
• 1.4.5 PCR产物的克隆
• 1.4.6 感受态细胞的制备和转化
• 1.4.7 质粒提取
• 1.4.8 琼脂糖凝胶电泳
• 1.4.9 平衡酚的制备
• 1.4.10 双酶切大片断的低熔点胶回收
• 1.4.11 重组质粒pUCmT-bgls的筛选和鉴定
• 1.4.12 重组质粒pET28 a（+）-bgls的构建
• 1.4.13 表达载体pET28（+）-bgls的筛选和鉴定
• 1.4.14 表达产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测
• 1.4.15 β葡聚糖酶基因的诱导表达
• 1.4.16 胞外、胞内和周质空间的β葡聚糖酶的提取
• 1.4.17 β-葡聚糖酶的酶活测定
• 1.4.18 β-葡聚糖酶的纯化
• 1.4.19 蛋白质含量测定
• 1.4.20 β-葡聚糖酶的最适反应温度
• 1.4.21 β-葡聚糖酶的热稳定性
• 2 结果与分析
• 2.1 β-葡聚糖酶基因的扩增
• 2.2 β-葡聚糖酶基因的克隆与鉴定
• 2.2.1 阳性重组质粒pUCmT-bgls的PCR鉴定
• 2.2.2 阳性重组质粒pUCmT-bgls的双酶切鉴定
• 2.2.3 β-葡聚糖酶基因的序列测定
• 2.3 重组表达载体的构建
• 2.3.1 表达载体和宿主的选择
• 2.3.2 重组表达载体pET28a（+）-bgls的构建思路
• 2.3.3 重组表达载体pET28a（+）-bgls的PCR鉴定
• 2.3.4 重组表达载体pET28a（+）-bgls的双酶切鉴定
• 2.3.5 重组表达载体pET28a（+）-bgls中目的序列的测定
• 2.4 重组表达载体pET28a（+）-bgls的诱导表达
• 2.5 胞外、胞内和周质空间的β-葡聚糖酶分布
• 2.6 β-葡聚糖酶的纯化
• 2.7 β-葡聚糖酶的热学性质
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 高通量筛选耐高温β-葡聚糖酶方法
• 0 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株、试剂
• 1.2 培养基和鉴定平板
• 1.3 主要仪器和设备
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 IPTG用量和加入方式对平板上的菌落生长和β-葡聚糖酶表达的影响
• 1.4.2 平板上的菌落密度对筛选的影响
• 1.4.3 细菌培养时间对筛选的影响
• 1.4.4 定位膜转印
• 1.4.5 筛选平板的制作和显色反应
• 1.4.6 β-葡聚糖酶酶活测定
• 2 结果
• 2.1 IPTG用量对平板上菌落生长和β-葡聚糖酶表达的影响
• 2.2 细菌培养时间对筛选的影响
• 2.3 菌落密度对筛选的影响
• 2.4 膜片处理温度对筛选的影响
• 2.5 耐高温β-葡聚糖酶菌株筛选方法的建立
• 2.6 以滤膜为基础的高通量筛选方法的稳定性考察
• 2.7 以滤膜为基础的高通量筛选方法与其它平板筛选方法的比较
• 3 讨论
• 4 结论
• 第四章 热稳定性β-葡聚糖酶的定向进化
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 培养基
• 1.3 主要仪器和设备
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 大肠杆菌质粒的提取
• 1.4.2 易错PCR扩增β-葡聚糖酶基因
• 1.4.3 随机突变酶的突变
• 1.4.4 DNA改组（DNA shuffling）
• 1.4.5 DEAE-纤维素膜电泳回收DNA小片段
• 1.4.6 回收双酶切的质粒载体
• 1.4.7 突变库的构建
• 1.4.8 含突变基因的表达文库的构建
• 1.4.9 突变文库的筛选
• 1.4.10 β-葡聚糖酶的纯化
• 1.4.11 β-葡聚糖酶活力测定
• 1.4.12 蛋白质的SDS-PAGE电泳
• 1.4.13 蛋白质浓度测定
• 1.4.14 DNA测序和序列比对
• 1.4.15 野生型酶和突变酶的催化动力学研究
• 1.4.16 野生型酶和突变酶的热稳定性
• 1.4.17 野生型酶和突变酶的最适反应温度
• 1.4.18 野生型酶和突变酶的最适pH值
• 1.4.19 野生型酶和突变酶的pH值稳定性
• 1.4.20 碱基和氨基酸序列比较分析
• 2 结果和分析
• 2.1 β-葡聚糖酶体外定向进化实验设计
• 2.2 β-葡聚糖酶基因的易错PCR
• 2.2.1 易错PCR条件的确定
• 2.2.2 突变文库中突变子产生透明圈的情况
• 2.2.3 随机突变文库的构建和筛选
• 2.2.4 热稳定性突变体的测序
• 2.3 第一代突变体基因的DNA改组
• 2.3.1 DNA改组的设计思路
• 2.3.2 DNA改组文库的构建
• 2.3.3 热稳定性酶的耐热机制分析
• 2.4 突变酶和野生酶的纯化鉴定
• 2.5 野生酶和突变酶的酶学性质
• 2.5.1 野生酶和突变酶的催化动力学
• 2.5.2 野生酶和突变酶的热稳定性和最适反应温度
• 2.5.3 野生酶和突变酶的最适pH值和pH值稳定性
• 3 讨论
• 4 结论
• 第五章 突变株EGS1和EGS2的遗传稳定性
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、质粒、酶及试剂
• 1.2 培养基
• 1.3 主要仪器和设备
• 1..4 实验方法
• 1.4.1 菌种传代方法
• 1.4.2 质粒对宿主的传代稳定性
• 1.4.3 β-葡聚糖酶活性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 质粒稳定性测定
• 2.1.1 EGs1突变株的质粒稳定性测定
• 2.1.2 EGs2突变株的质粒稳定性测定
• 2.2 突变株各代细胞表达目的产物的稳定性
• 2.2.1 EGs1突变株的表达稳定性
• 2.2.2 EGs2突变株的表达稳定性
• 3 讨论
• 4 结论
• 第六章 热稳定性突变体EGS2的发酵工艺研究
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂、材料
• 1.2 主要仪器和设备
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 菌种活化
• 1.3.2 装液量、接种量和初始pH值的优化
• 1.3.3 IPTG对目的产物表达的影响
• 1.3.4 乳糖对目的产物表达的影响
• 1.3.5 诱导温度对目的产物表达的影响
• 1.3.6 菌株EGs2的生物量测定
• 2 结果与分析
• 2.1 最佳装液量、接种量和初始pH的确定
• 2.2 目的产物表达和菌体生长的条件优化
• 2.2.1 IPTG和乳糖浓度对菌体生长和目的产物表达的影响
• 2.2.2 诱导时间对菌体生长和目的产物表达的影响
• 2.2.3 诱导温度对菌体生长和目的产物表达的影响
• 3 讨论
• 4 结论
• 第七章 保护剂对β-葡聚糖酶稳定性影响的研究
• 0 前言
• 1 实验材料、仪器和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要仪器和设备
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 β-葡聚糖酶活力测定
• 1.3.2 保护剂的筛选
• 1.3.3 β-葡聚糖酶的热稳定性实验
• 1.3.4 β-葡聚糖酶的加速实验
• 2 结果与分析
• 2.1 不同物质对β-葡聚糖酶热稳定性的影响
• 2.2 保护剂浓度对β-葡聚糖酶热稳定性的影响
• 2.3 复合保护剂配方的优化
• 2.4 复合保护剂对β-葡聚糖酶热稳定性的影响
• 2.5 复合保护剂对β-葡聚糖酶储存稳定性的影响
• 3 讨论
• 4 结论
• 第八章 β-葡聚糖酶的储存寿命估算
• 0 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要仪器和设备
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 β-葡聚糖酶活力测定
• 1.3.2 蛋白质含量测定
• 1.3.3 β-葡聚糖酶的加速实验
• 1.3.4 实验数据的处理
• 2 结果与分析
• 2.1 β-葡聚糖酶加速稳定性实验测定结果
• 2.2 β-葡聚糖酶在28℃、36.2℃和45℃下的热降解速度
• 2.3 β-葡聚糖酶在不同温度下的热降解速度
• 2.4 β-葡聚糖酶储存寿命的估算
• 3 讨论
• 4 结论
• 第九章 结论与后续研究展望
• 1 结论
• 2 后续研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 附：个人简历及攻读博士学位期间发表的论文