论文摘要
目的:研究自噬/溶酶体途径在海人藻酸受体（KA受体）介导的神经兴奋性毒性中的作用。 方法:采用脑立体定位纹状体内给药法,建立KA受体介导的大鼠神经兴奋性毒性模型,DNA ladder法观察不同剂量KA所引起的DNA核小体间降解,透射电镜观察纹状体神经元中自噬体形成和溶酶体激活,Western Blot检测cathepsin B、cathepsin L的蛋白表达,双标记免疫组化法观察cathepsin B的表达定位。底物活性测试法检测自噬体抑制剂3-methyladenine（3-MA）和溶酶体酶cathepsin B抑制剂Z-FA-FMK对模型大鼠纹状体中cathpsin B表达的影响,DNA ladder法及尼氏染色法观察3-MA和Z-FA-FMK对模型大鼠纹状体神经元的保护作用。免疫组化法检测3-MA和Z-FA-FMK对模型大鼠纹状体内溶酶体相关膜蛋白Lamp-1和抗凋亡基因Bcl-2表达的影响,Western Blot检测3-MA和Z-FA-FMK对模型大鼠纹状体内Bcl-2、caspase-3、cyto-c表达的调节。 结果:KA所引起的凋亡条带呈剂量依赖性趋势,透射电镜显示大鼠纹状体KA注射1小时后即可见纹状体神经元内自噬体形成,8小时后自噬体出现最明显;Western Blot结果显示模型大鼠纹状体内cathepsin B表达增加,而cathepsin L无明显变化。双标记免疫组化结果显示模型大鼠纹状体内cathepsin B阳性的细胞增多,且表达于受损神经元中。3-MA、Z-FA-FMK给药组与模型组相比,底物活性检测中cathepsin B活性明显降低（P<0.01）,DNA ladder凋亡条带明显减弱,损伤面积显著减小（P<0.01）。免疫组化结果显示KA使Lamp-1表达增加、Bcl-2表达减少,而3-MA和Z-FA-FMK给药组可抑制KA所引起的Lamp-1和Bcl-2蛋白表达的变化。Western Blot结果显示3-MA和Z-FA-FMK有对抗KA模型大鼠纹状体中Bcl-2下调、caspase-3激活和cyto-c从线粒体释放入细胞浆的作用。 结论:KA受体介导的神经兴奋性毒性导致的神经元凋亡与自噬和溶酶体的激活有关,自噬体抑制剂和溶酶体酶抑制剂可通过影响自噬/溶酶体介导的细胞信号机制抑制凋亡的发生,从而对KA所致的大鼠纹状体神经元损伤起保护作用。