MAPKs通路在兔骨关节炎软骨细胞表达MMP-1/-13中作用的研究

论文摘要

背景骨关节炎（osteoarthritiS,OA）是一种慢性、退变性关节疾病,是老年人最常见的关节疾病。OA以中老年患者多见,女性多于男性。60岁以上的人群中患病率可达50%,75岁的人群则达80%。随着老龄社会的到来,OA已成为导致老龄者病废的主要疾病之一,造成的社会负担和医疗费用在不断增加。目前研究认为,OA是由多种因素引起关节软骨退变而导致的关节疾病,其病因尚不明确,其发生与年龄、肥胖、炎症、创伤及遗传因素等有关。众多的细胞因子在OA的发病过程中有重要的作用,其中白介素-1（IL-1）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）最为重要。它们通过自分泌或旁分泌的形式作用于关节滑膜细胞和软骨细胞,产生金属蛋白酶（MMPs）、一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）等,抑制蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成,促进细胞外基质（ECM）降解,最终引起关节炎。虽然细胞因子学说并不能完全解释OA的病理机制,但是关节软骨的退变离不开炎症因子的作用。相关的研究表明,IL-1β和TNF-α与相应的受体结合后,可经丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-actirated proteinkinases,MAPKs）途径和核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）途径进行细胞内信号转导,最终引起MMPs增高、自由基生成、细胞凋亡等一系列过程,从而参与了OA的发病。然而目前对IL-1β和TNF-α通过MAPKs引起MMP-1/-13具体通路研究以及它们之间的异同并不清楚。本实验应用real-time PCR和western blot等技术,研究IL-1β和TNF-α作用于兔关节软骨细胞后MMP-1/-13的变化以及不同,进一步研究其对MAPKs各通路蛋白的影响,并应用MAPKs抑制剂和IL-1β联合作用,分别阻断各MAPKs通路,观察对MMP-1/-13的影响。通过实验明确各MAPKs通路在骨关节炎关节软骨细胞MMP-1/-13表达增高中的具体调节作用,为进一步研究在OA发病中软骨细胞MMP-1/-13增高的分子机制提供理论基础。第一部分IL-1β和TNF-α对兔关节软骨细胞表达MMP-1/-13和NO的影响目的体外培养兔关节软骨细胞,观察IL-1β和TNF-α对体外培养的兔关节软骨细胞MMP-1,-13和NO表达的影响,明确它们之间的不同。材料和方法取新西兰兔关节软骨,体外分离培养关节软骨细胞并鉴定。分别用IL-1β和TNF-α作用于关节软骨细胞不同时间（8h,16h,24h,36h）。以real-time PCR技术检测MMP-1/-13mRNA的变化。另外收取细胞培养上清液,用Western blot检测MMP-1/-13蛋白变化,并用Griess反应测定NO的变化。结果通过倒置显微镜下细胞形态学检查,甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原染色,证明所培养细胞是软骨细胞。IL-1β能引起MMP-1/-13表达的增高,MMP-1随着时间延长持续增高,而MMP-13增高后维持在一高水平。TNF-α并不能引起它们的增高。IL-1β和TNF-α都可以引起NO的表达增高。结论兔关节软骨细胞可以被成功分离和培养。IL-1β能使得MMP-1和MMP-13表达增高,但两者增高趋势不同。TNF-α并不能引起兔关节软骨细胞MMP-1/-13的增高。IL-1β和TNF-α都可以促进NO的分泌增加。第二部分IL-1β对兔关节软骨细胞MAPKs信号通路蛋白表达的影响目的观察IL-1β对兔关节软骨细胞MAPKs各条通路蛋白表达的影响。材料和方法将体外培养的软骨细胞随机分为空白对照组和用IL-1β（10ng/ml）作用不同时间组（作用时间分别为15min,30min,45min,60min）,用Western blot方法检测软骨细胞中ERK1/2、JNK1/2和p38通路总蛋白和活性蛋白（磷酸化蛋白）的表达。结果在IL-1β作用下,与对照组比较,1h内各MAPKs通路总蛋白没有明显变化;而各磷酸化蛋白在作用15min后表达明显增高,p-ERK1/2增高维持至60min,p-JNK1/2在15min增高至顶峰后,开始下降,至60min时回到正常水平;p-p38增高到30min后开始下降,至60min时回到正常水平。各组与对照组比较差异有统计学意义。结论IL-1β不能引起MAPKs通路总蛋白的变化,却能明显引起磷酸化蛋白的增高。第三部分MAPKs通路在兔骨关节炎软骨细胞表达MMP-1/-13和NO中的作用目的应用MAPKs各条通路阻滞剂抑制骨关节炎软骨细胞,观察对MMP-1/-13和NO的影响,明确其各条通路在MMP-1/-13表达中的作用。材料和方法体外培养兔关节软骨细胞,设置空白对照组和IL-1β（10ng/ml）作用组,各MAPK通路阻滞剂ERK,PD98059（20μM）、JNK,SP600125（25μM）、p38,SB230585（10μM）作用细胞30min后,加入IL-1β（10ng/ml）共同作用24h,应用real-time PCR检测MMP-1/-13mRNA的变化。收取细胞培养上清液,用Griess反应测定NO的变化。结果IL-1β作用后软骨细胞MMP-1/-13mRNA表达增高,加入阻滞剂后,MMP-1/-13表达明显下降。ERK通路阻滞剂PD98059抑制作用29.6%（MMP-1）,39.2%（MMP-13）;p38通路阻滞剂SB203580抑制作用47.7%（MMP-1）,37.7%（MMP-13）;JNK通路阻滞剂SP600125抑制作用为55.4%（MMP-1）,52.2%（MMP-13）。P38通路抑制剂SB203580能明显抑制NO表达。结论在兔骨关节炎软骨细胞MMP-1,13表达增高中,MAPKs通路起了重要的作用。对于MMP-1表达,可能是JNK和p38通路起主要作用,而MMP-13表达,起主要作用的是ERK和JNK通路。P38通路参与了IL-1β诱导的NO表达。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 IL-1β和TNF-α对兔关节软骨细胞表达MMP-1/-13和NO的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 IL-1β对兔关节软骨细胞MAPKs信号通路蛋白表达的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 MAPKs通路在兔骨关节炎软骨细胞表达MMP-1/-13和NO中的作用
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 致谢