可利用淀粉的car1基因缺失酿酒酵母工程菌构建

论文摘要

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate, EC）是存在于黄酒中的潜在致癌物,有研究表明,市售黄酒中的EC含量普遍超过联合国粮农组织所设定的限量标准,因此开展降低黄酒中EC含量的研究势在必行。黄酒中的EC主要是由尿素与乙醇反应所生成,因此我们可以从菌种改造及原辅料添加等方面避免引入EC前体物。本研究通过SFH-PCR介导的基因敲除技术对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） AH109中精氨酸酶基因进行敲除,得到敲除子SΔcarl。对其进行黄酒发酵分析,对比其与出发菌株发酵性能的差异,并对黄酒成品的氨基酸和EC含量进行对比分析。最后,分别构建两个淀粉酶表达载体SΔcarl/Al和Sδcarl/A2,使淀粉酶基因分别在ADH1及ADH2启动子控制下表达。并对其转化菌进行淀粉酶表达情况的对比。实验结果如下：1.酿酒酵母精氨酸酶基因car1的敲除通过SFH-PCR获得酿酒酵母精氨酸酶基因敲除盒,将其直接转化酿酒酵母AH109进行基因敲除,在含200μg/mL G418的抗性平板上筛选出阳性敲除子并进行PCR验证,敲除子命名为SΔcarl。将敲除子接种到以0.1%精氨酸为主要氮源的YNBG液体培养基上摇瓶培养,分析整个过程中的精氨酸酶活力。结果显示敲除子因无法利用培养基中主要氮源精氨酸,生长速度比原始菌株缓慢；原始菌株AH109在18h时精氨酸酶活性达到最大值（5.2U）随后下降,而敲除子SΔcarl则在整个培养过程中均未检测出明显的精氨酸酶活性,证明精氨酸酶基因已被成功敲除。2.精氨酸酶基因敲除菌株S△carl的黄酒发酵分析模拟黄酒酿造的工艺,将敲除菌株SΔcarl及原始菌株AH109分别接入糯米糖化液中进行黄酒发酵,并监测发酵过程。结果表明,精氨酸酶基因的敲除对酿酒酵母发酵过程影响不大。对成品黄酒中氨基酸的对比分析表明,野生型菌株发酵黄酒中精氨酸含量为0.44g/100L,而敲除菌株所产黄酒中精氨酸含量为5.3g/100L,约为野生型的12倍；敲除菌株所产黄酒中鸟氨酸含量为0.58g/100L,而野生型菌株所产黄酒中鸟氨酸含量为1.98g/100L,约为敲除菌株的3倍。此外,与精氨酸代谢非直接相关的赖氨酸和半胱氨酸含量变化较明显,野生型菌株所产黄酒中赖氨酸和半胱氨酸含量分别为1.46g/100L,0.63g/100L,而敲除菌株所产黄酒中赖氨酸和半胱氨酸含量分别为3.16g/100L,1.38g/100L,约为野生型的2倍。在80℃下分别对两种黄酒进行煎酒加速实验,并对成品黄酒中的EC含量进行对比分析,结果表明,野生菌株所产黄洒中EC含量为40.65μg/L,敲除菌株SΔcar1发酵黄酒中EC含量为5.93μg/L,约为野生菌株的1/8。由此可见,酿酒酵母精氨酸酶基因的敲除虽能显著降低发酵黄酒中的EC含量,但不能完全避免EC的产生,这可能是由原辅料中引入了一定量EC前体物所导致的。3.淀粉酶表达盒的构建及酵母转化分析通过酶切连接反应,分别以ADH1和ADH2启动子构建了淀粉酶的表达载体pADH1/ALP1和pADH2/ALP1,并转化SΔcar1,在以淀粉为唯一碳源的YNBS平板上筛选后,通过PCR验证获得转化子分别命名为SΔcar1/A1和SΔcar1/A2。分析不同浓度葡萄糖对SΔcar1/A1和SΔcar1/A2菌株产淀粉能力的影响,结果表明SΔcar1/A1随着葡萄糖浓度的增加,透明圈逐渐变大,SΔcar1/A2则相反,随着葡萄糖浓度的增加,透明圈逐渐变小。说明ADH2启动子受到葡萄糖的负调控作用,而ADH1则不受此作用影响。尽管如此,ADH2启动子表现出比ADH1启动子更强的表达效率。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 EC及其危害
• 2 EC的形成机理
• 2.1 尿素与乙醇共反应生成EC
• 2.2 以植物中氰苷水解物为前体合成EC
• 2.3 食品添加剂引入的EC前体物
• 3 EC的检测方法
• 4 EC的控制
• 5 黄酒中的EC
• 6 基因敲除技术在酵母工程菌构建中的应用
• 7 利用淀粉的酿酒酵母基因工程菌研究进展
• 8 本研究目的、内容与意义
• 第二章 酿酒酵母car1基因的敲除
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 主要试剂及培养基
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 敲除盒的构建
• 1.2.2 酿酒酵母精氨酸酶基因敲除
• 1.2.3 敲除子的筛选与鉴定
• 1.2.4 酿酒酵母基因组提取
• 1.2.5 酿酒酵母敲除子生长动力学及产精氨酸酶进程分析
• 2 结果与分析
• 2.1 car1敲除盒的构建
• 2.2 酿酒酵母AH109中car1基因的敲除
• 2.3 酿酒酵母敲除子PCR验证
• 2.4 敲除子SΔcar1生长曲线和产精氨酸酶进程分析
• 3 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 第三章 敲除子SΔcar1发酵黄酒特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 黄酒的制作
• 1.2.2 黄酒发酵过程理化指标分析
• 1.2.3 黄酒成品中氨基酸种类及含量分析
• 1.2.4 黄酒成品中EC含量测定
• 2 结果与分析
• 2.1 发酵过程中酒精度、总糖分析
• 2.2 发酵过程pH、酸度分析
• 2.3 成品黄酒中氨基酸种类及含量分析
• 2.4 成品中EC含量分析
• 3 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 第四章 高效淀粉酶表达盒的构建及酵母转化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 PCR体系及程序
• 1.2.3 质粒DNA的提取
• 1.2.4 大肠杆菌感受态的制备
• 1.2.5 转化大肠杆菌
• 1.2.6 pADH1/ALP1表达载体的构建
• 1.2.7 pADH2/ALP1表达载体的构建
• 1.2.8 表达载体转化酵母敲除子SΔcar1
• 1.2.9 转化子筛选、鉴定及对比分析
• 2 结果与分析
• 2.1 Saccharomycopsis fibuligera ALP1基因的克隆
• 2.2 pADH1/ALP1表达载体构建
• 2.2.1 MCS的克隆
• 2.2.2 pADH1表达载体构建
• 2.2.3 pADH1/ALP1表达载体构建
• 2.3 pADH2/ALP1表达载体构建
• 2.4 淀粉酶表达载体转化SΔcar1
• 2.5 转化子鉴定及对比分析
• 3 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 第五章 结论与展望
• 1 结论
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢