高致病性PRRSV WUH3株分离鉴定及体外传代的遗传变异研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种传染病,以妊娠母猪繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状引起高死亡率为特征。早在1987年该病在美国南部被报道,随后遍及世界各地,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。2006年,我国暴发了一种“猪高热综合症”,以高发病率、高热和高死亡率为特征。研究者通过很多研究,证实高致病性PRRSV变异株是“猪高热综合症”的主要病原。针对这种新的PRRSV,本研究进行了病毒的分离与鉴定,将分离毒株WUH3株在Marc-145细胞上进行体外传代传75代,对WUH3株亲本株、第25代（P25）、第50代（P50）、第75代（P75）进行全基因组测序,利用分子生物学各种软件对不同代次细胞毒全基因组做生物信息学分析,研究WUH3株在体外传代过程中传代毒株之间遗传进化规律,为高致病性PRRSV WUH3株不同代次细胞毒之间氨基酸的变异和毒力的关系提供分子水平的依据,为研发高致病性PRRSV弱毒疫苗提供理论和技术上的支持。主要研究内容包括：1.高致病性PRRSV WUH3株的分离、鉴定在“猪高热综合症”发生时期利用Marc-145细胞对疑似发病猪的组织进行病毒分离,并通过RT-PCR、间接免疫荧光等试验证实分离的病毒为PRRSV,命名为PRRSV WUH3株。2.高致病性PRRSV WUH3株的体外传代高致病性PRRSV WUH3株利用Marc-145细胞体外传代至75代,第5代细胞毒接毒后3d出现局灶性病变,5d后出现70%细胞病变。随着传代次数不断增加,出现细胞病变的时间不断缩短,由最初3d缩短到75代的24 h,产生70%细胞病变的时间由最初5d缩短到第75代的48 h, TCID50殖总体呈上升趋势,毒量不断地增高,这说明在体外传代过程中WUH3株适应细胞能力不断增强。3.高致病性PRRSV WUH3株全基因组的序列分析将高致病性PRRSV WUH3株及其传代细胞毒株P25,P50,P75做全基因序列测定并进行分析。全基因组序列比对结果表明,PRRSV WUH3株及其传代细胞毒株与国内现在流行的高致病性PRRSV具有相似的遗传标记,即Nsp2存在30个氨基酸的不连续缺失以及5’UTR和3’UTR各缺失一个碱基。与WUH3株亲本株相比,WUH3株传代细胞毒P75存在149个核苷酸突变,导致了65个氨基酸发生有义突变。利用各种生物学软件对4代全基因组序列及氨基酸做生物信息学分析,结果显示,很多氨基酸突变位于PRRSV基因组功能区。比如信号肽序列（P4SORF4）,跨膜区序列（L172FORF4,P173AORF4,S174IORF4）,N-糖基化位点序列（S133NORF3）,有些抗原表位也发生了变化（A181TNSP2）,这些氨基酸的突变可能在病毒的复制,蛋白转运,信号转导中有一定作用。另外,PRRSV WUH3株传代与JXA1株同步传代过程中有8个位点的突变方向相似,即E303DNSP2,E296DNSP3, N162SNSP7,R204HNSP10,F251SORF2,L172FORF4,P173AORF4,S174IORF4,推测这8个位点在PRRSV传代过程中毒株毒力致弱有一定作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 历史回顾
• 1.2 猪繁殖和呼吸综合征病毒病原学研究
• 1.2.1 猪繁殖和呼吸综合征病毒的分类
• 1.2.2 PRRSV的理化特性
• 1.2.3 PRRSV的抗原性
• 1.2.4 PRRSV的体外培养特性
• 1.2.5 PRRSV的致病机理
• 1.3 PRRSV分子生物学研究进展
• 1.3.1 PRRSV基因组结构与功能
• 1.3.2 PRRSV编码的蛋白及功能
• 1.3.3 PRRSV基因组变异
• 1.3.4 PRRSV毒力变异
• 1.3.5 PRRSV的抗原性变异
• 第2章 研究目的与意义
• 第3章 高致病性PRRSV WUH3株适应细胞连续传代
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 病料与细胞
• 3.1.2 试剂及溶液配制
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 病料采集与处理
• 3.2.2 病毒的分离
• 3.2.3 病毒的增值与传代
• 3.2.4 病毒的纯化
• 50的测定'>3.2.5 TCID₅₀的测定
• 3.2.6 分离病毒的间接免疫荧光鉴定
• 3.2.7 PRRSV基因组RNA的提取
• 3.2.8 本实验所用的引物及扩增条件
• 3.2.9 PCR产物的电泳检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 PRRSV病毒的分离
• 3.3.2 间接免疫荧光试验（IFA）
• 3.3.3 病毒的RT-PCR检测
• 3.3.4 细胞培养病毒液TCIDso的测定结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 PRRSV的细胞培养
• 3.4.2 PRRSV体外反复传代致弱
• 3.5 小结
• 第4章 高致病性PRRSV WUH3株不同代次病毒基因遗传变异研究
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 菌株与细胞
• 4.1.2 载体与质粒
• 4.1.3 工具酶及主要试剂
• 4.1.4 主要缓冲液与相关试剂及其配制
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 PRRSV基因组RNA的提取和PCR产物电泳检测
• 4.2.2 用DNA快速回收试剂盒回收纯化酶切产物DNA或PCR产物
• 4.2.3 外源DNA片段与载体的连接反应
• 4.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 4.2.5 连接产物的转化
• 4.2.6 质粒的制备与鉴定
• 4.2.7 重组质粒（阳性质粒）的鉴定
• 4.2.8 重组子测序
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 全基因组扩增与克隆
• 4.3.2 全基因组序列拼接与分析
• 4.3.3 5’UTR核苷酸序列分析
• 4.3.4 3’UTR核苷酸序列分析
• 4.3.5 ORF1a编码的氨基酸变异分析
• 4.3.6 ORF1b编码的氨基酸变异分析
• 4.3.7 ORF2编码的氨基酸变异分析
• 4.3.8 ORF3编码的氨基酸变异分析
• 4.3.9 ORF4编码的氨基酸变异分析
• 4.3.10 ORF5编码的氨基酸变异分析
• 4.3.11 ORF6编码的氨基酸变异分析
• 4.3.12 毒力相关氨基酸的推测与变异分析
• 4.3.13 PRRSV WUH3株与其他强毒株的传代过程比较与分析
• 4.4 讨论
• 4.4.1 PRRSV WUH3株5'UTR及3'UTR的变异
• 4.4.2 PRRSV WUH3株非结构蛋白氨基酸的变异
• 4.4.3 PRRSV WUH3株结构蛋白氨基酸的变异
• 4.4.4 PRRSV WUH3株全基因组中毒力相关位点的变异
• 4.5 小结
• 参考文献
• 致谢