论文摘要
研究背景恶性肿瘤是危及人类生命的首要原因,临床上较为常见的恶性肿瘤,如乳腺癌、前列腺癌及肺癌等,易发生骨转移,加上原发的骨肉瘤,均会引起病理性的骨痛（简称骨癌痛）,极大的干扰了患者的日常生活,并可导致患者死亡率的增高、体能状态的下降及焦虑或抑郁的发生,因此如何改善患者的生活质量成为当前亟待解决的问题。由于对骨癌痛相关机制认识的不足,目前的治疗方案难以达到令人满意的疗效,且常伴有严重的副作用,延误了疼痛的缓解,某种程度上甚至加速了癌症的恶化,因此极有必要寻求一种基于机制的、新的治疗方案。脊髓上高级中枢以极为精细的方式下行调控脊髓水平痛觉信息的传递和处理,延髓头端腹内侧区（rostral ventromedial medulla,RVM）作为该调控系统最主要的下行通路,直接影响了大脑和脊髓间痛觉信息的“中继”,大量行为学和电生理学的研究提示RVM区内表达μ阿片受体的下行易化神经元可能直接参与了病理性疼痛的形成,对脊髓水平“中枢敏化”的维持发挥了极为关键的作用,因此这些易化神经元可能成为治疗慢性顽固性疼痛的新靶点。基于此,通过μ阿片受体介导选择性阻断RVM区下行易化作用可能成为治疗骨癌痛的一种有效措施。本实验首先构建大鼠骨癌痛模型,通过应用靶向毒素——皮啡肽-皂角素耦联体,靶向毁损大鼠RVM区内μ阿片受体阳性的下行易化神经元,探讨此治疗方案应用于骨癌痛的有效性和安全性。另外鉴于皮啡肽-皂角素耦联体起效慢、制作工艺复杂、价格昂贵、难以形成产业化等缺点,本实验模拟皂角素在靶细胞内诱导凋亡的过程,进一步构建大鼠源性自发活化的caspase-3重组促凋亡基因,以期为骨癌痛的靶向基因治疗奠定实验基础。研究方法与结果1. Mu阿片受体介导靶向毁损骨癌痛大鼠下行易化系统镇痛效应的研究方法:成年雌性Wistar大鼠96只,随机分为6组:正常对照组（6只,不接受任何处理）、肿瘤细胞接种组（18只,仅构建骨癌痛模型,RVM区不接受任何微注射）、PBS（Phosphate buffered saline,磷酸盐缓冲液）组（18只）、皮啡肽组（18只）、皂角素组（18只）和皮啡肽-皂角素组（18只）,其中后四组大鼠RVM区依次接受PBS、皮啡肽、皂角素及皮啡肽-皂角素耦联体单次微注射处理。微注射后第28d,除正常对照组外所有大鼠右侧胫骨接种Walker 256乳腺癌细胞构建大鼠骨癌痛模型,肿瘤细胞接种后第3d开始观察各组大鼠痛觉行为学改变,包括机械性痛觉超敏、机械性痛觉过敏、冷痛觉超敏、热痛觉过敏及移动诱发痛评分至细胞接种后第20d。肿瘤细胞接种后第7d、14d及20d,影像学观察肿瘤细胞接种侧胫骨骨质破坏的程度,免疫组化法检测各组脊髓背角FOS阳性神经元的数目和星形胶质细胞的活化,并采用ELISA法检测脊髓实质中前炎症因子IL-1β和TNF-α的改变。结果:1)疼痛行为学检测:肿瘤细胞接种组、PBS组、皮啡肽组及皂角素组大鼠与正常对照组大鼠相比均有痛觉超敏（nociceptive hypersensitivity）的发生（P<0.05）,而RVM区微注射皮啡肽-皂角素耦联体可在痛觉超敏发生后的47d内明显降低痛觉超敏的程度（P<0.05,与肿瘤细胞接种组相比）。2)影像学检查:所有接种肿瘤细胞的大鼠接种侧胫骨骨质呈现进行性的破坏,各种RVM区微注射处理对局部骨质的破坏无明显影响;3)脊髓Fos阳性神经元的数目:肿瘤细胞接种组、PBS组、皮啡肽组及皂角素组大鼠脊髓双侧Fos阳性的神经元数目较正常对照组显著增加（P<0.05）,而细胞接种后第14d和第20d,皮啡肽-皂角素组大鼠脊髓双侧Fos阳性神经元数目与肿瘤细胞接种组相比明显降低（P<0.05）,且与正常对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。4)活化星形胶质细胞的数目及前炎症因子IL-1β和TNF-α的表达:肿瘤细胞接种组、PBS组、皮啡肽组及皂角素组大鼠脊髓双侧活化的星形胶质细胞数目和前炎症因子IL-1β和TNF-α的表达均较正常对照组大鼠显著增加（P<0.05）,而RVM区微注射皮啡肽-皂角素耦联体可明显降低活化的星形胶质细胞的数目并抑制前炎症因子IL-1β和TNF-α的产生（P<0.05,与肿瘤细胞接种组大鼠相比）,并在细胞接种后第20d回落至正常对照组水平（P>0.05）。2. Mu阿片受体介导靶向毁损大鼠痛觉下行易化系统安全性评估方法:成年雌性Wistar大鼠102只,随机分为五组:正常对照组（6只,不做任何处理）、PBS组（24只）、皮啡肽组（24只）、皂角素组（24只）及皮啡肽-皂角素组（24只）,其中后四组大鼠RVM区依次接受PBS、皮啡肽、皂角素及皮啡肽-皂角素耦联体单次微注射处理。从微注射后第4d开始至第28d,每4d对大鼠生命体征进行检测。微注射后第4d、7d、14d及28d,通过超声心动图检测大鼠心功能的反应,免疫组化法检测RVM区内神经元数目以及局部星形胶质细胞和小胶质细胞的活化, Real-time PCR及ELISA法检测局部前炎症因子IL-1β和TNF-α的表达。结果:1)生命体征: RVM区内微注射皮啡肽-皂角素耦联体对大鼠基本生理功能无显著影响（P>0.05,与正常对照组相比）,包括体重、肛温、呼吸频率、心率及收缩压。2)超声心动图检测心功能:微注射后第7d、14d及28d,皮啡肽-皂角素耦联体组大鼠左心室射血分数（left ejection fraction, EF）、左心室短轴分数（left fractional shortening, FS）、左心室收缩末期内径（left ventricular internal dimension systole at end-diastole, LVIDS）和左心室舒张末期内径（left ventricular internal dimension diastole at end-diastole, LVIDD）与正常对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。3)神经元数目:皮啡肽-皂角素组大鼠RVM区NeuN标记的神经元总数与正常对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）;4)胶质细胞的活化及前炎症因子IL-1β和TNF-α的表达:与正常对照组相比,皮啡肽-皂角素组大鼠RVM区内小胶质细胞和星形胶质细胞无显著活化,前炎症因子IL-1β和TNF-α持续维持在基线水平（与正常对照组相比,P>0.05）。3.大鼠源性自发活化caspase-3重组基因的构建及其促凋亡效应的研究方法:模拟皂角素在细胞内诱导凋亡的过程,通过重组PCR技术获得大、小亚基顺序颠倒的大鼠源性自发活化的重组caspase-3基因,经酶切电泳及测序分析后,克隆入真核表达载体pcDNA3.1（+）或EGFP-C1,转染大鼠永生化神经前体细胞（Immortalized neural progenitor cells,INPC）和人胚肾293T细胞,分别通过荧光倒置显微镜观察细胞形态学改变、Annexin V-PI双标后流式细胞仪检测转染细胞的早期凋亡率、MTT法检测转染后细胞的生长抑制率及Western blot检测转染后细胞内活化caspase-3蛋白质的表达。结果:1)转染24h后荧光倒置显微镜显示转染重组caspase-3基因的细胞呈现明显的细胞碎裂、浓缩及细胞突起回缩等典型的凋亡形态学改变。2)转染重组caspase-3基因的细胞Annexin V-PI双染后流式细胞仪检测显示细胞早期凋亡率分别为: 16.01%±1.03%（INPC）和30.67%±1.53%（293T）,与正常对照组、空白载体组或野生型caspase-3组细胞相比显著增高（P<0.05）;3)MTT结果提示转染重组caspase-3基因的细胞生长抑制率分别为: 44.61%±0.15%（INPC）和48.35±0.16%（293T）,与正常对照组、空白载体组或野生型caspase-3组细胞相比生长抑制率明显增加（P<0.05）;4)Western blot结果提示转染重组caspase-3基因的细胞中活化caspase-3蛋白的相对表达量分别为:2.44±0.01 （INPC）和3.42±0.21（293T）,较正常对照组、空白载体组或野生型caspase-3组细胞显著增加（P<0.05）。4.统计学处理采用SigmaStat 3.0统计软件进行处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示,实验第一部分组间、组内比较采用双因素方差（Two way ANOVA）分析后post-hoc检验（SNK法）,余实验部分中组间、组内比较采用单因素方差（One way ANOVA）分析后SNK法。P<0.05设定为差异有统计学意义。研究总结1. RVM区微注射皮啡肽-皂角素耦联体选择性毁损μ阿片受体表达阳性的下行易化神经元,可降低脊髓中枢敏化的程度,抑制脊髓内星形胶质细胞的活化和前炎症因子的产生,显著抑制骨癌痛大鼠痛觉超敏的程度。2. RVM区微注射皮啡肽-皂角素耦联体选择性毁损μ阿片受体表达阳性的下行易化神经元对实验大鼠生理功能无明显影响,超声心动图结果亦提示对大鼠心功能影响较小。耦联体注射后也未引起局部神经元的显著丢失和明显的神经炎症或神经免疫反应。3.通过模拟皂角素在靶细胞内诱导凋亡的过程,成功构建了大鼠源性自发活化的caspase-3重组基因,在无前凋亡信号的作用下可自发诱导细胞凋亡。研究意义本研究从慢性病理性疼痛脊髓上内源性调控系统入手,根据RVM区在该系统下行投射至脊髓过程中的“中继”作用,应用皮啡肽-皂角素耦联体选择性毁损了RVM区内μ阿片受体表达阳性的下行易化神经元,有效降低了骨癌痛的程度,同时研究结果也证实了靶向毁损效应应用的安全性。本研究是对骨癌痛基于机制治疗的一种新探索,为将该靶向毁损的治疗方案应用于临床提供了实验依据。鉴于皂角素自身的诸多缺点,本研究模拟皂角素诱导细胞凋亡的过程,构建了大鼠源性自发活化的caspase-3重组促凋亡基因,为骨癌痛的靶向基因治疗提供了理想的杀伤基因。