对虾白斑综合症病毒（WSSV）囊膜基因vp28、鲤鱼生长激素基因GH的克隆和表达

论文摘要

对虾白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV）是一种具有囊膜的双链DNA病毒,是造成自1993年以来中国、东南亚及美洲等世界范围内大面积暴发对虾病毒性疾病的主要病原。该病传播速度快,感染虾群在3～7d内死亡率高达90～100%,对我国及世界的对虾养殖造成了严重的危害,而目前尚未有有效的防治方法。WSSV的基因组大小为305,107bp,有5个主要的结构蛋白VP28、VP19、VP26、VP24和VP15。 囊膜蛋白是病毒感染与致病力的重要决定因子,WSSV有两个主要的囊膜蛋白VP19和VP28,其中VP28蛋白已被证明在病毒的吸附、侵入过程中起着重要的作用。现已有研究证明利用大肠杆菌表达的WSSV的囊膜蛋白VP28具有提高对虾抗WSSV感染的能力。 鱼的生长激素是一种由鱼的脑垂体分泌的多肽类激素,具有促进鱼的生长发育和调节体内代谢的作用。现研究证明鱼生长激素对某些贝类幼体及对虾苗也有明显的促进生长发育和提高免疫力的作用。 本研究采用逆转录—聚合酶链式反应（RT-PCR）的方法,从鲤鱼脑垂体总RNA中扩增出编码鲤鱼生长激素（GH）成熟肽基因序列,以含vp28基因的质粒为模板,PCR扩增得到vp28目的序列,分别构建了鲤鱼生长激素（GH）的高效表达工程菌株E.coliBL21（DE3）-pET-GH和WSSV囊膜蛋白vp28高效表达工程菌株E.coli BL21（DE3）-pET-vp28。 本研究用大肠杆菌表达鲤鱼生长激素（GH）与WSSV囊膜蛋白vp28,意在利用这两种表达产物的可以提高对虾的免疫能力,尤其是抗WSSV感染的能力的特性,期望将其应用于对虾的水产养殖业中。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 生长激素研究进展
• 1.1 生长激素及其家族成员
• 1.2 生长激素的分泌和调节
• 1.3 鱼类生长激素结构和生物学功能研究进展
• 1.3.1 生长激素的分子结构特点及同源性比较
• 1.3.1.1 生长激素的分子结构
• 1.3.1.2 生长激素的同源性比较
• 1.4 生长激素作用机理
• 1.5 鱼生长激素在水产养殖中的应用
• 2 对虾白斑综合症病毒
• 2.1 对虾白斑综合症的病原体
• 2.1.1 对虾白斑综合症病毒（WSSV）的命名
• 2.1.2 对虾白斑综合症病毒（WSSV）的分类地位
• 2.2 对虾白斑综合症的症状及病理变化
• 2.2.1 对虾白斑综合症的症状
• 2.2.2 对虾白斑综合症的病理变化
• 2.3 WSSV的大小、形态结构
• 2.4 WSSV的感染宿主、传播途径
• 2.4.1 WSSV的感染宿主的大小、形态结构
• 2.4.2 WSSV的传播途径
• 2.5 WSSV感染的动物模型
• 2.6 WSSV的基因组及其编码的多肽
• 2.6.1 WSSV的基因组及其稳定性
• 2.6.2 WSSV基因组编码的多肽
• 2.6.2.1 WSSV病毒粒子的主要结构蛋白
• 2.6.2.2 结构蛋白之间的同源性及其理化特点
• 3 本研究的背景、目的和意义
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 菌种和质粒
• 1.2 常用工具酶及试剂盒
• 1.3 引物
• 1.4 培养基
• 1.5 常用溶液
• 1.5.1 小量碱法制备质粒所用溶液
• 1.5.2 琼脂糖凝胶电泳所用溶液
• 1.5.3 丙烯酰胺凝胶电泳所用溶液
• 1.5.4 Western blotting所用溶液
• 1.5.5 其它溶液的配制
• 1.6 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 碱裂解法提取质粒DNA
• 2.2 PCR
• 2.3 PCR产物的回收与纯化
• 2.4 连接
• 2.5 转化
• 2.5.1 冷氯化钙法制备感受态细胞
• 2.5.2 质粒转化大肠杆菌JM109感受态细胞
• 2.6 阳性重组子的检测
• 第一章 囊膜蛋白基因vp28在大肠杆菌中的克隆，表达
• 0 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 PCR扩增vp28基因
• 1.2.2 克隆载体pMD18-T28的构建
• 1.2.3 重组表达载体的构建
• 1.2.4 外源蛋白在E.coli BL21（DE3）中的表达
• 1.2.4.1 E.coli BL21（DE3）-pET-vp28的诱导表达
• 1.2.4.2 基因工程蛋白的粗提取
• 1.2.4.3 表达产物的SDS-PAGE鉴定
• 1.2.4.4 Western blotting检测
• 2 结果
• 2.1 PCR扩增vp28基因
• 2.2 重组质粒pET-vp28的构建和鉴定
• 2.3 外源蛋白在E.coli BL21（DE3）中的表达
• 2.4 表达产物的Western blotting检测
• 3 讨论
• 第二章 鲤鱼生长激素在大肠杆菌中的克隆，表达
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 鲤鱼脑垂体总RNA提取
• 1.2.2 引物设计与合成及RT-PCR
• 1.2.3 克隆载体的构建
• 1.2.4 DNA序列测序
• 1.2.5 重组表达质粒的构建
• 1.2.6 外源蛋白在E.coli BL21（DE3）中的表达
• 1.2.6.1 E.coli BL2l（DE3）-pET-GH的诱导表达
• 1.2.6.2 基因工程蛋白的粗提取
• 1.2.6.3 表达产物的SDS-PAGE鉴定
• 2 结果
• 2.1 总RNA的提取
• 2.2 RT-PCR扩增鲤鱼GH cDNA
• 2.3 克隆载体的构建与筛选
• 2.4 DNA序列分析
• 2.5 表达载体的构建和筛选
• 2.6 外源蛋白在E.coli BL21（DE3）中的表达
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢