耐酸生淀粉糖化酶的初步研究

论文摘要

本研究通过对大曲和淀粉厂周围的土壤样品进行筛选,共筛出能够直接利用生玉米淀粉的菌种约18株,又通过复筛获得8株能够产生酸性生淀粉糖化酶（在pH 3.6,30℃的条件下相对可以较好的水解生玉米淀粉）的菌种,其中MS-09的酶活最高,达到15.20 U/mL,选定为出发菌株。通过菌落形态和ITS保守区序列分析及基于ITS的系统进化树分析,确定该菌为一株烟曲霉,命名为Aspergillus fumigalus MS-09。通过单因素实验对Aspergillus fumigalus MS-09产酸性生淀粉糖化酶的发酵条件进行研究,确定为:发酵初始pH 7.0,30℃培养92 h,装液量为10 %,摇瓶转速为250 r/min。该菌产酸性生淀粉糖化酶的最适碳源为2 %的玉米粉（干热灭菌）。Plackett-Burman多因素实验设计法,确定了影响Aspergillus fumigalus MS-09产酸性生淀粉糖化酶的主要因素为蛋白胨、NaNO3和KH2PO4。进一步通过响应面分析法和典型性分析得出培养基的最佳组成为:玉米粉（干热灭菌）20 g/L、蛋白胨6.79 g/L、KH2PO4 2.14 g/L和NaNO3 27.81 g/L,预测酸性生淀粉糖化酶的最大酶活27.02 U/mL。验证性实验证明在优化条件下,Aspergillus fumigalus MS-09产酸性生淀粉糖化酶达27.59 U/mL。Aspergillus fumigalus MS-09产生的酸性生淀粉糖化酶经过硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换和Sephadex G-75分子筛纯化后,酶的比活力由27.32 U/mg提高到了129.67 U/mg。对纯化后酶的性质进行了研究发现,其最适作用温度为45℃,最适作用pH为5.0,该酶具有很好的耐酸稳定性。金属离子对酶活力的影响研究表明Na+和Ca2+对该耐酸生淀粉糖化酶有激活作用,Hg2+、Fe3+、Zn2+和Cu2+对该酶有抑制作用。HPLC分析了该酶水解生玉米淀粉的产物,发现葡萄糖是唯一的水解产物。所以该酶是一种耐酸生淀粉糖化酶。将该耐酸生淀粉糖化酶应用于生玉米粉酒精发酵,发酵结束后醪液中的酒精体积分数达8.6 %,发酵周期为5天。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 生淀粉糖化酶的来源
• 1.2 生淀粉糖化酶的结构
• 1.3 生淀粉糖化酶的作用机理
• 1.4 生淀粉糖化酶研究进展
• 1.5 生淀粉糖化酶的应用
• 1.5.1 生淀粉糖化酶应用于生料发酵
• 1.5.2 生淀粉糖化酶其它方面的应用
• 1.6 本论文的目的意义与主要研究内容
• 1.6.1 本论文的立题意义
• 1.6.2 本论文的研究内容
• 第二章 耐酸生淀粉糖化酶产生菌的筛选和鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要试剂与仪器
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 实验方法
• 2.1.4 菌种初步鉴定
• 2.1.5 菌种分子生物学鉴定
• 2.1.6 酸性生淀粉糖化酶的酶活力的测定方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 葡萄糖标准曲线
• 2.2.2 淀粉琼脂平板上透明圈的直径d 与ARSDG 酶活A 的关系
• 2.2.3 菌种筛选结果
• 2.2.4 菌种初步鉴定
• 2.2.5 菌种的分子生物学鉴定
• 2.3 本章小结
• 第三章 Aspergillus fumigalus MS-09 发酵产酶条件研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 液体发酵条件
• 3.1.4 酸性生淀粉糖化酶活力测定方法
• 3.1.5 Plackett-Burman 实验设计筛选培养基组成
• 3.1.6 中心组成实验设计优化培养基组成
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 Plackett-Burman 实验设计确定产酶培养基组成
• 3.2.2 Box-Behnken 实验设计进一步优化产酶培养基
• 3.2.3 最佳培养基组成的确定
• 3.2.4 发酵底物（碳源）对产酶的影响
• 3.2.5 Aspergillus fumigalus MS-09 产酸性生淀粉糖化酶发酵条件的研究
• 3.2.6 Aspergillus fumigalus MS-09 产酸性生淀粉糖化酶发酵条件的确定
• 3.3 本章小结
• 第四章 耐酸生淀粉糖化酶的分离纯化及性质研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 酸性生淀粉糖化酶的生产菌株
• 4.1.2 酸性生淀粉糖化酶粗酶液的制备
• 4.1.3 酸性生淀粉糖化酶活力测定方法
• 4.1.4 蛋白质浓度测定方法
• 4.1.5 硫酸铵沉淀
• 4.1.6 DEAE-纤维素离子交换柱层析
• 4.1.7 Sephadex G-75 柱层析
• 4.1.8 蛋白质分子量的测定
• 4.1.9 酸性生淀粉糖化酶的酶学性质
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 蛋白质标准曲线
• 4.2.2 酸性生淀粉糖化酶的硫酸铵盐析曲线
• 4.2.3 DEAE-纤维素离子交换色谱
• 4.2.4 Sephadex G-75 柱层析
• 4.2.5 蛋白质分子量测定
• 4.2.6 酸性生淀粉糖化酶的纯化结果
• 4.2.7 酸性生淀粉糖化酶的主要酶学性质
• 4.2.8 HPLC 对酶解产物的分析
• 4.3 本章小结
• 第五章 耐酸生淀粉糖化酶应用于生玉米粉酒精发酵
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 原料
• 5.1.2 主要药品和试剂
• 5.1.3 仪器设备
• 5.1.4 酵母的活化
• 5.1.5 酒精发酵
• 5.1.6 分析方法
• 5.1.7 酒精度的测定方法
• 5.2 生料酒精发酵中的残总糖和酒精体积分数变化曲线
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文