甜蛋白Monellin在大肠杆菌中的高效表达

论文摘要

本研究设计单链monellin基因,利用大肠杆菌表达系统,构建高表达的Monellin重组大肠杆菌工程菌,从而提高Monellin的稳定性;并用乳糖代替IPTG作为诱导剂,以降低生产成本。同时对两种载体（pET22b和pET28a）构成的大肠杆菌表达系统的表达效果进行了比较。1根据monellin基因的序列,按照Coden Usage Database数据库（NCBI-GenBank）中大肠杆菌密码子的偏爱性,人工设计并合成monellin基因。并在合成基因的5’端添加NcoⅠ酶切位点,在基因的3’端添加BamHⅠ酶切位点,将合成好的全基因通过NcoⅠ/BamHⅠ位点克隆到pET22b载体上。构建重组载体pET22b-Mon,将重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,得到表达monellin的大肠杆菌工程菌株DE3-pET22b-Mon。再用NcoⅠ、BamHⅠ从含甜蛋白monellin基因的pET22b上切下monellin基因,并将其插入到pET28a的NcoⅠ、BamHⅠ位点之间,构建重组载体pET28a-Mon,将重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,得到表达Monellin的大肠杆菌工程菌株DE3-pET28a-Mon。2以摇瓶发酵为基础,探讨了不同载体构成的大肠杆菌工程菌在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下的表达,研究了诱导起始生长量、诱导培养温度、诱导培养时长及接种量对目的蛋白表达的影响。对于大肠杆菌工程菌株DE3-pET22b-Mon,其诱导优化条件如下:在装液量为20mL/100mL摇瓶中,按1%的接种量接种,当OD600值达到0.73时,添加诱导剂IPTG至终浓度为1.0mmol/L,37℃继续培养6h后,Monellin的表达量达到细菌总蛋白的22.26%。对于大肠杆菌工程菌株DE3-pET28a-Mon,其诱导优化条件如下:在装液量为20mL/100mL摇瓶中,按1%的接种量接种,当OD600值达到1.0时,添加诱导剂IPTG至终浓度为1.0mmol/L,37℃继续培养6h后,Monellin的表达量高达细菌总蛋白的34.08%。3以摇瓶发酵为基础,探讨了不同载体构成的大肠杆菌工程菌在乳糖诱导下的表达,研究了诱导剂浓度、诱导起始生长量、诱导培养温度、诱导培养时长及接种量对目的蛋白表达的影响。对于大肠杆菌工程菌株DE3-pET22b-Mon,其诱导优化条件如下:在装液量为20mL/100mL摇瓶中,按3%的接种量接种,当OD600值达到1.0时,添加诱导剂乳糖至终浓度为10g/L,37℃继续培养7h后,Monellin的表达量占细菌总蛋白的19.86%。对于大肠杆菌工程菌株DE3-pET28a-Mon,其诱导优化条件如下:在装液量为20mL/100mL摇瓶中,按3%的接种量接种,当OD600值达到1.0时,添加诱导剂乳糖至终浓度为11g/L,37℃继续培养8h后,Monellin的表达量占细菌总蛋白的33.09%。4在摇瓶发酵的基础上,以DE3-pET28a-Mon为研究对象,选用终浓度为11g/L的乳糖作为诱导剂,采用5L的发酵罐进行小试。发酵终产物OD600=6.02,菌体湿重=18.5g,得到的纯化Monellin为0.06g。性质较天然Monellin有显著改善:中性条件下,60℃下保温50min仍具有强烈的甜味,70℃保温5min仍有甜味;在pH=3,50℃下仍有甜味。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 甜味剂在饲料中的应用现状
• 1.1.1 成为饲用甜味剂的条件
• 1.1.2 动物甜味剂的应用现状
• 1.1.3 甜味剂的发展趋势
• 1.2 甜蛋白的研究进展
• 1.2.1 甜蛋白的种类和基本性质
• 1.2.2 甜蛋白的结构和功能
• 1.2.3 甜蛋白的甜味机理研究
• 1.2.4 甜蛋白的工业化现状和前景
• 1.3 pET系统和乳糖诱导
• 1.3.1 pET系统简介
• 1.3.2 乳糖诱导表达简介
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 实验研究
• 2.1 实验一植物甜蛋白Monellin重组菌株的构建
• 2.1.1 材料与方法
• 2.1.2 结果与讨论
• 2.1.3 小结
• 2.2 实验二 IPTG诱导甜蛋白Monellin在大肠杆菌中的表达
• 2.2.1 材料和方法
• 2.2.2 结果与讨论
• 2.2.3 小结
• 2.3 实验三乳糖诱导甜蛋白Monellin在大肠杆菌中的表达
• 2.3.1 材料与方法
• 2.3.2 结果与讨论
• 2.3.3 小结
• 2.4 实验四甜蛋白Monellin性质的检测
• 2.4.1 材料与方法
• 2.4.2 结果与讨论
• 2.4.3 小结
• 第三章 结论和建议
• 3.1 本研究的主要结论
• 3.2 本研究的创新之处
• 3.3 有待进一步解决的问题
• 参考文献
• 致谢
• 缩写符号说明
• 攻读学位期间的研究成果