CD59配体肽基因真核表达体系的构建及对前列腺癌PC-3细胞活性的作用研究

论文摘要

目的构建CD59分子配体肽（sp22）基因真核表达重组体系,探讨sp22基因对细胞CD59分子表达及功能的影响,为进一步研究sp22分子与CD59分子的作用机制及利用短肽封闭CD59分子表达,为肿瘤基因靶向治疗开辟新途径。方法构建含特异性sp22基因的真核重组表达载体sp-pIRES,脂质体法转染人前列腺癌PC-3细胞,G418筛选建立稳定转染细胞系,RT-PCR检测转染细胞中sp22基因mRNA的表达并筛选阳性细胞克隆,RT-PCR检测转染细胞表面CD59mRNA表达量的变化,Western Blot、ELISA竞争抑制试验检测转染细胞CD59蛋白的表达；制备抗CD59多克隆抗体,台盼蓝染色试验和LDH试验检测sp22分子对CD59分子功能的影响,MTT法测定PC-3细胞增殖抑制率。结果PCR、双酶切及DNA测序鉴定表明成功构建了sp-PIRES真核重组表达载体；RT-PCR试验证实sp22在spPC-3细胞中成功表达；Western Blot、ELESA竞争抑制试验表明：spPC-3细胞比正常PC-3细胞CD59蛋白表达量减少,二者比较其差别有统计学意义（P<0.05）；与正常PC-3细胞相比,补体对spPC-3细胞的溶解杀伤能力明显增强,二者比较其差别有统计学意义（P<0.05）; MTT结果测定spPC-3细胞与正常PC-3细胞相比较细胞增殖抑制率增高,差别有统计学意义（P<0.05）。结论sp22基因可在mRNA及蛋白水平抑制人前列腺癌PC-3细胞表面CD59蛋白分子的表达及功能,降低CD59分子抗补体活性,为进一步研究利用SP22阻断CD59分子在肿瘤细胞上的表达创造了有利条件,为肿瘤的免疫治疗研究奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器设备
• 1.1.2 质粒、菌株与细胞株
• 1.1.3 主要试验试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 sp-pIRES重组表达载体的构建及鉴定
• 1.2.1.1 sp22基因序列的选择与设计
• 1.2.1.2 引物设计
• 1.2.1.3 sp-dsDNA的制备
• 1.2.1.4 sp-18T重组克隆载体的构建及鉴定
• 1.2.1.5 sp-pIRES重组表达载体的构建及鉴定
• 1.2.2 PC-3细胞的转染及稳定转染细胞克隆的筛选
• 1.2.2.1 PC-3细胞的培养
• 1.2.2.2 PC-3细胞的转染
• 1.2.2.3 稳定转染细胞克隆的建立
• 1.2.2.4 PC-3细胞内总RNA提取
• 1.2.2.5 sp22 RT-PCR mRNA水平筛选阳性细胞克隆
• 1.2.2.6 转染细胞CD59基因mRNA水平RT-PCR检测
• 1.2.2.7 转染细胞CD59蛋白水平Western blot检测
• 1.2.3 兔抗人CD59多克隆抗体的制备
• 1.2.4 CD59分子的生物学活性检测
• 1.2.4.1 ELISA竞争抑制试验
• 1.2.4.2 台盼蓝染色试验
• 1.2.4.3 LDH检测
• 1.2.4.4 MTT检测
• 1.2.4.5 统计学处理
• 第二章 实验结果
• 2.1 sp-pIRES重组表达载体的构建及鉴定
• 2.1.1 sp-dsDNA的制备
• 2.1.2 sp-18T重组克隆载体PCR及单酶切鉴
• 2.1.3 sp-pIRES重组表达载体PCR及双酶切鉴定
• 2.1.4 sp-pIRES重组表达载体DNA测序鉴定
• 2.2 重组质粒转染PC-3细胞的筛选及鉴定
• 2.2.1 PC-3细胞的培养
• 2.2.2 阳性细胞克隆的筛选
• 2.2.3 Western blot检测
• 2.2.4 ELISA竞争抑制试验检测
• 2.3 功能检测
• 2.3.1 台盼蓝染色测定补体溶细胞功能
• 2.3.2 乳酸脱氢酶实验（LDH）测定补体杀伤率
• 2.3.3 MTT法测定细胞增殖抑制率
• 第三章 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 附录
• 致谢