论文摘要
在急性心肌梗死（AMI）患者中,开通心脏表面的梗死相关血管固然重要,但心肌组织水平灌注不良,即无复流现象（no-reflow phenomenon）,严重影响其临床预后。因此,心肌微血管的功能状态受到人们越来越多的关注。无复流现象形成的确切机制尚未完全明了,但中性粒细胞黏附并释放炎性介质、纤维蛋白血栓形成、血小板的聚集、内皮细胞结构及功能损伤等因素造成的冠状动脉微循环障碍,是引起无复流现象的重要因素。近30余年的基础与临床研究证明,炎症介导动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）发生与发展的每一个环节,被认为是AS的独立危险因素。在心肌缺血/再灌注（I/R）损伤过程中,炎症损伤贯穿于心肌细胞损伤的全过程,且能够渗透到其它损伤因素中发挥作用。白介素6（IL-6）是AS斑块中的炎性标志物,其血清水平升高见于AMI、不稳定性心绞痛、经皮冠脉介入治疗（PCI）后和PCI后再狭窄。IL-6刺激血小板聚集和组织因子、高敏C反应蛋白（hs-CRP）、纤维蛋白原的表达。肾素-血管紧张素系统（RAS）与AS及其伴随的炎症相关,并可以损伤血管内皮的功能。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）不仅在血管壁内有明显致炎症作用,而且在循环细胞内也可以被某些因素激活,如血糖、血胰岛素水平等。AngⅡ受体拮抗剂无论在体内或体外均能减少致炎与致动脉硬化因子,如活性氧、核因子kappa B和hs-CRP;血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）通过干扰黏附分子和细胞因子的表达而发挥抗炎作用。但是炎症、RAS及内皮功能与无复流的关系尚不清楚。因此,本研究建立兔AMI再灌注无复流模型,观察AMI及再灌注后炎症、RAS及内皮功能的变化,探讨无复流现象发生的机制及防治措施,为临床防治无复流提供新的思路和方法。目的:1.探讨兔AMI再灌注后循环和心肌炎症的变化及其与无复流现象的关系;评价阿托伐他汀对炎症的影响及对无复流的防治作用。2.探讨兔AMI再灌注后循环和心肌RAS的变化及其与无复流现象的关系;评价贝那普利对AMI再灌注后RAS的作用及无复流的影响。3.探讨兔AMI再灌注后内皮功能的变化及其对无复流现象发生的作用;评价阿托伐他汀或阿魏酸钠对内皮素-1（ET-1）的影响及其对无复流的防治作用。方法:1.动物分组与模型的建立56只新西兰大白兔随机分为7组,每组8只:（1）假手术组,术前12h 0.9%盐水10ml灌胃;（2）AMI 1h组:术前12h 0.9%盐水10ml灌胃;（3）AMI4h组（对照组）:术前12h 0.9%盐水10ml灌胃;（4）阿托伐他汀1组:阿托伐他汀10mg·kg-1,术前12h用0.9%盐水10ml溶解后灌胃1次;（5）阿托伐他汀2组:阿托伐他汀5mg·kg-1·d-1,术前每日用0.9%盐水10ml溶解后灌胃1次,共3d ;（6）贝那普利组:贝那普利3mg·kg-1·d-1,术前每日用0.9%盐水10ml溶解后灌胃1次,共3d;（7）阿魏酸钠组:阿魏酸钠20mg·kg-1 ,冠脉结扎前5分钟由兔耳缘静脉持续滴注6小时。AMI1h组冠脉结扎1h,再灌注2h;AMI4h组及4个治疗组冠脉结扎4h,再灌注2h,建立缺血/再灌注模型;假手术组冠脉下只穿线、不结扎。2.无复流面积及梗死面积的计算再灌注后,按1 ml·kg-1从左心房注入60g/L硫磺素,使复流区着色,无复流区不着色;再于原位重新结扎冠脉左回旋支（LCX）,从左心房注入Evan’s蓝,使结扎区外着蓝色,结扎区不着蓝色。立即处死动物,取出心脏,剪除左右心耳、右心室及残余大血管,并沿心脏长轴分为5～7心肌短轴切片,结果非结扎区心肌呈蓝色,结扎区在紫外线灯下无复流区不显色,有再流处显色。最后,将整个心肌切片放入四氮唑红（triphenyltetrazolium chloride,TTC）溶液中染色,梗死心肌不着色,非梗死部位心肌呈砖红色,立即对切片进行拍照。结扎区心肌范围（ligation area , LA）=结扎区心肌面积/左心室室壁心肌面积,无复流心肌范围（area of no-reflow, ANR）=无复流区面积/结扎区心肌面积。坏死心肌范围（necrosis area, NA）=梗死心肌面积/结扎区心肌面积。3.血流动力学测定:右颈动脉置管经换能器连接至Lead2000型多导生理记录仪检测血液动力学参数。4.血清IL-6测定:采用酶联免疫吸附法（ELISA）。5.心肌组织中干扰素γ（IFN-γ）、P-选择素（Ps）和血管紧张素转换酶（ACE）2表达检测:采用免疫组织化学法。6.血浆及心肌AngⅡ、ET-1的测定:采用放射免疫方法。7.心肌组织ACE mRNA的表达:采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）的方法测定。结果:1.各组血流动力学参数变化与假手术组比较,AMI组AMI前各指标差异均无统计学意义。与AMI前相比较,AMI 1h组在AMI后1h和再灌注后2h,HR、SBP及DBP均显著下降（P<0.01）。AMI 4h组上述各项指标变化与AMI 1h组的变化趋势相同。AMI 1h组与AMI 4h组比较,HR在AMI前、AMI后与再灌注后均无显著性差异（P均> 0.05）;SBP及DBP在AMI后与再灌注后两个时间点,AMI 4h组较AMI 1h组的SBP及DBP均显著下降（P< 0.05或P< 0.01）。阿托伐他汀1组、2组在AMI后4h和再灌注后2h上述各项指标较AMI前均显著下降（P均<0.01）;另外,阿托伐他汀1组、2组SBP、DBP下降幅度明显低于对照组（P < 0.01）。2.各组炎性介质变化以及阿托伐他汀的抗炎及心肌保护作用（1）在AMI 1h组中, AMI后1h、再灌注后2h的血清IL-6较AMI前显著升高,且均显著高于假手术组（ P < 0.01 ）。AMI 4h组与AMI 1h组的变化趋势相同。除AMI前外,AMI 4h组各时间点的血清IL-6均显著高于AMI 1h组（P< 0.05或P< 0.01）。除AMI前外,各治疗组各时间点血清IL-6均显著低于对照组（P<0.05或P< 0.01）。（2）HE染色结果显示,AMI 1h组中,复流区心肌细胞有变性无明显坏死,炎性细胞少;而无复流区较复流区心肌坏死明显,炎性细胞数量较多。AMI 4h与AMI 1h组相比,复流区及无复流区心肌细胞变性坏死及炎症反应程度更重。阿托伐他汀1组、2组与对照组比较,复流区及无复流区心肌细胞变性坏死及炎症反应均明显减轻。（3）Ps免疫组织化学法结果显示,AMI组中,Ps在复流区及无复流区血管内皮细胞有强表达,明显强于正常区（P均<0.01）;并且无复流区表达强于复流区（P均<0.01）。AMI 4h与AMI 1h组相比,Ps在复流区和无复流区心肌组织中表达更强（P <0.05及P=0.01）。阿托伐他汀1组、2组与对照组比较,Ps在复流区及无复流区表达均明显减弱（P<0.05或P <0.01）。（4） IFN-γ免疫组织化学法结果显示,AMI组中, IFN-γ在复流区及无复流区血管内皮细胞有强表达,明显强于正常区（P<0.05或P <0.01）;并且无复流区表达强于复流区（P <0.01）。AMI 4h与AMI 1h组相比, IFN-γ在复流区和无复流区心肌组织中表达更强（P <0.01或P<0.05）。阿托伐他汀1组、2组与对照组比较, IFN-γ在复流区及无复流区表达均明显减弱（P均<0.01）。（5）兔AMI再灌注后均出现无复流现象。AMI 4h与AMI 1h组相比,无复流心肌范围（area of no-reflow, ANR）显著增大（85.67±4.94% vs 75.26±3.27%,P < 0.01 ） ,坏死心肌范围（necrosis area,NA）亦显著增大（96.56±2.26% vs 87.24±4.95%,P < 0.01 ）。阿托伐他汀1组、2组,结扎区心肌范围（ligation area , LA）分别为37.45±3.25%、37.92±3.92%,与对照组（36.87±2.16%）相比差异无统计学意义（P均>0.05）;ANR分别为47.01±6.89%、44.52±4.24%,与对照组（85.67±4.94%）相比显著降低（P均< 0.01 ） ,NA分别为85.94±7.01%、87.21±4.46%,与对照组（96.56±2.26%）相比亦显著降低（P均< 0.01）。3.循环和局部心肌组织中RAS组分变化及贝那普利干预的影响（1）AMI 1h组AMI后1h、再灌注后2h的血浆AngⅡ均显著高于假手术组（ P均< 0.01 ）;与AMI前比较显著升高（ P均< 0.01 ） ,并且随时间递增而增高（ P均< 0.01）。AMI 4h组与AMI 1h组的变化趋势相同。除AMI前外,AMI 4h组各时间点的血浆AngⅡ均显著高于AMI 1h组（P均< 0.01） ,贝那普利组各时间点的血浆AngⅡ均显著低于对照组（AMI 4h组）（P < 0.01）。（2）AMI组复流区和无复流区心肌组织中AngⅡ含量均显著高于正常区心肌组织（ P均< 0.01 ） ,且无复流区AngⅡ含量高于复流区（ P均< 0.01）。除正常区,AMI 4h组各区心肌组织中AngⅡ含量均显著高于AMI 1h组（P均< 0.01）。除正常区,贝那普利组各区的心肌AngⅡ均显著低于对照组（复流区P < 0.01,无复流区P < 0.05）。（3）HE染色显示,AMI1h组中,复流区心肌细胞有变性,坏死不明显,炎症反应轻;而无复流区较复流区心肌细胞变性、坏死及炎症反应严重。AMI 4h与AMI 1h组相比,复流区及无复流区心肌细胞变性坏死及炎症反应程度更重。贝那普利组与对照组比较,复流区及无复流区心肌细胞变性坏死程度均显著减轻。（4）ACE2免疫组织化学法结果显示,ACE2阳性染色信号定位于血管内皮细胞。与正常区相比较,AMI组复流区和无复流区心肌组织中ACE2的表达均明显增加（P均<0.01）。而无复流区比复流区表达更显著（P均<0.01）。AMI 4h与AMI 1h组相比,复流区和无复流区ACE2表达均显著增强（P均<0.05）。（5）IFN-γ免疫组织化学法结果显示, IFN-γ阳性染色信号定位于血管内皮细胞。与正常区心肌组织相比较,AMI组复流区和无复流区心肌组织中IFN-γ的表达均明显增加（P <0.01或P<0.05）。而无复流区比复流区表达更显著（P均<0.01）。AMI 4h与AMI 1h组相比,在复流区和无复流区IFN-γ表达均显著增强（P <0.01或P<0.05）。贝那普利组与对照组比较, IFN-γ在复流区和无复流区表达明显减弱（P均<0.01）。（6）AMI组复流区心肌组织中ACE的mRNA表达均显著高于正常区心肌组织（P均<0.01 ）,而无复流区心肌组织中ACE的mRNA表达均显著低于正常及复流区心肌组织（P均<0.01）。AMI 4h与AMI 1h组比较,仅复流区ACE的mRNA表达显著增加（P<0.01）。贝那普利组与对照组比较,仅复流区ACE的mRNA有下降趋势,但不显著（P=0.052）。（7）贝那普利组与对照组相比,LA差异无统计学意义（37.62±2.90% vs 36.87±2.16%,P > 0.05）, ANR显著降低（45.12±4.62% vs 85.67±4.94%,P < 0.01 ） ,NA亦显著降低（86.05±5.22% vs 96.56±2.26%,P < 0.01 ）。4.缺血、再灌注和无复流中的内皮损伤以及阿托伐他汀和阿魏酸钠的拮抗作用（1）AMI 1h组在AMI后1h、再灌注后2h的血浆ET-1均显著高于假手术组（ P < 0.01 ）;与AMI前比较亦显著升高,且随时间推移递增（ P < 0.01）。AMI 4h组与AMI 1h组的变化趋势相同。除AMI前,AMI 4h组各时间点的血浆ET-1均显著高于AMI 1h组（P < 0.01）。除AMI前,阿魏酸钠和阿托伐他汀治疗组各时间点的血浆ET-1均显著低于对照组（P均< 0.01）。（2）AMI组复流区和无复流区心肌组织中ET-1含量均显著高于正常区心肌组织（ P < 0.01 ） ,且无复流区ET-1含量高于复流区（ P < 0.01）。除正常区,AMI 4h组各区心肌组织中ET-1含量均显著高于AMI 1h组（P < 0.01）。治疗组仅复流区心肌组织中的ET-1含量显著低于对照组（ P < 0.01 ）。（3）阿托伐他汀1组、2组及阿魏酸钠组与对照组比较,复流区及无复流区心肌细胞变性坏死程度均显著减轻。（4）阿托伐他汀1组、2组及阿魏酸钠组,LA分别为37.45±3.25%、37.92±3.92%、38.03±4.05%,与对照组（36.87±2.16%）相比差异无统计学意义（P均>0.05）; ANR分别为47.01±6.89%、44.52±4.24%、78.52±6.13%,与对照组（85.67±4.94%）相比显著降低（阿魏酸钠组P<0.05,其余P均< 0.01 ） ;NA分别为85.94±7.01%、87.21±4.46%、92.00±2.99%,与对照组（96.56±2.26%）相比,阿托伐他汀1组、2组亦显著降低（P均< 0.01）,而阿魏酸钠组无显著降低（P > 0.05）。结论:1.兔AMI再灌注后缺血心肌发生炎症反应,某些炎性因子（IL-6、IFN-γ、Ps）的含量及表达增强,炎症反应程度与缺血时间有关;阿托伐他汀短期或一次应用均有抗炎作用,能有效防治无复流现象的发生,减少梗死面积。炎症可能是无复流发生的重要机制之一。2.兔AMI再灌注后心肌缺血缺氧引起循环及心肌局部RAS均明显激活,AngⅡ生成及释放增加,心肌ACE mRNA表达增强,加重无复流现象;贝那普利通过抑制RAS的激活,能有效防治无复流的发生,减少心肌梗死面积。RAS的激活可能是无复流发生的重要机制之一。3.兔AMI再灌注后心肌缺血缺氧引起内皮素生成释放增多,血管内皮功能障碍;阿托伐他汀具有保护内皮细胞功能,有效防治无复流的发生,减少梗死范围。阿魏酸钠也有保护内皮细胞功能,防治无复流的发生,但不能减少梗死范围。
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