论文摘要
急性心肌梗死（AMI）后的心室重构是心室扩张、心功能不全甚至死亡的主要原因,它是一个复杂的动态的而且是时间依赖性的过程。心室重构不仅影响心肌细胞,使心肌细胞凋亡、坏死、肥大、延长,还表现心肌纤维化,即细胞外基质（ECM）的合成和降解的动态平衡被打破,心肌间质和心肌内小血管周围胶原过度增多、沉积,并且出现炎性细胞浸润。导致心肌纤维化形成的病理生理机制与心脏压力负荷过重以及炎症、肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAS）等因素有关。上述因素作用于细胞外基质,使细胞外基质胶原的合成减少、分解增多以及成分改变,促使心室的扩张,影响心室的结构和功能,最终导致心脏功能的减弱甚至心室破裂。心脏中75%的细胞是非心肌细胞,其中产生细胞外物质的成纤维细胞占90%-95%,由此可见成纤维细胞功能的改变是影响心室重构的重要因素。心肌成纤维细胞产生大部分基质大分子包括胶原和结构蛋白,主要是Ⅰ和Ⅲ型胶原,形成胶原网络结构,维持心脏的几何形态,并使心脏成为一个具有高度协调的舒缩器官。而有序的细胞外基质的降解是心脏生长、重构、修复的关键,其主要是由基质金属蛋白酶（MMPs）和其抑制剂（TIMPs）之间的相互作用来完成的。MMPs是一组以锌离子为辅助因子的蛋白酶家族,心脏的MMPs主要由成纤维细胞、内皮细胞、炎症细胞等细胞产生。MMPs在心脏基质的重构中发挥重要作用,一种MMPs可以直接降解某种或几种细胞外基质,也可以通过激活其它类型的MMPs而产生作用,从而形成瀑布效应;在心脏中,MMPs不仅对心脏基质成分起降解作用,而且调节胶原蛋白的合成,使正常胶原蛋白被升高的MMPs降解并被缺乏连接结构的纤维性间质所取代,使心肌纤维化增加。MMP-2、MMP-9是其中重要的组成成分,起降解变性的胶原纤维、其他类型的胶原和弹力蛋白。一旦MMPs结合到胶原纤维并开始作用时,它们能持续的作用直至所有的胶原都降解完毕或者被TIMPs抑制。AMI时MMPs/TIMPs的失衡,使得MMPs增加或者TIMPs的减少,或者MMPs/TIMPs比率增高,促使不良重构的发生。动脉粥样硬化（AS）是导致AMI发生的根本原因。目前认为其发生发展是一个动态过程,涉及感染、炎症、免疫多种机制。而氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）始终贯穿其中,它被巨噬细胞吞噬,转化成泡沫细胞,形成脂质斑块。不稳定的脂质斑块破裂导致血栓形成,发生AMI。发生AMI后,血液中的IL-1、IL-6、血小板源生长因子（PDGF）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等促炎因子的浓度大幅度升高,可促进心肌细胞的肥大和凋亡,同时它们还可能通过影响了细胞外基质,从两方面同时影响了心室的不良重构。IL-1β是AMI时升高的众多的促炎因子之一,它具有免疫调节活性作用,对不同来源的细胞有不同的生物学作用。IL-1β能通过细胞表面的白介素受体（IL-1R）减少胶原的合成及MAPK途径来刺激心肌成纤维细胞的迁移,从而参与心室的不良重构。然而对于AMI发生后,ox-LDL是否同时促进心室的重构,两者之间是否协同促进心室重构的发生,目前研究不多。已有研究表明ox-LDL可以使高同型半胱氨酸血症的患者外周血单核细胞的MMP-9的表达增高,而正常人MMP-9表达不增高。ox-LDL还可以通过羰基蛋白形成和激活表皮生长因子受体信号途径来促使MMP-2生成增多,降解胶原。由此可见,AMI后的心室重构是个复杂的过程,在此过程中,ox-LDL、IL-1β等多种因素介导的细胞外基质降解和合成的动态平衡得以打破,使得正常结构的胶原组织降解,合成的无序的胶原纤维,使得心室重构的发生,最终导致心室功能不良。AMI后的抗重构治疗的目的是防止、限制甚至逆转不良的重构,阻止心室扩张、功能失调、无能和死亡。其中一个重要的方面就是在重构过程中保护细胞外基质。由于AMI后心室重构从心肌梗死的愈合、修复直至数月甚至数年,在此过程中,机械变形和增加的室壁压力持续作用于梗死区和非梗死区,促进心室的扩张、纤维化,故治疗的起始点和持续时间是关键所在,需要早期和长期的抗重构治疗。而一旦已经发生心衰,尽管心室重构可以停止,但心衰改善不明显。目前抗心肌重构治疗的药物主要有ACEI、ARB、醛固酮拮抗剂、β-受体拮抗剂等等。新近发现他汀类药物除调脂外,尚有抗炎、抗氧化、减少炎性递质水平、抑制凝血因子激活、抑制自身抗体形成、抑制内皮细胞粘附分子和组织因子表达、降低斑块中T细胞和巨噬细胞活性以及维持斑块稳定等作用。为此应用他汀类药物早期干预,是否可以延缓或者改善心室的重构,从而改善MI后患者的死亡率呢?我们用IL-1β联合ox-LDL刺激心肌成纤维细胞,观察MMPs的改变及胶原合成的变化,并用辛伐他汀（Sim）进行干预,为临床进行抗心室重构治疗奠定一定的基础。本实验分为三个部分,首先通过3H-脯氨酸掺入法、明胶酶谱法、蛋白质免疫印迹法和逆转录聚合酶链反应等方法,检测IL-1β对体外培养的心肌成纤维细胞胶原合成及促进胶原降解的基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9表达的影响。接着于体外提取并氧化低密度脂蛋白,并采用上述方法检测ox-LDL对心肌成纤维细胞胶原合成及MMP-2、MMP-9表达的影响。最后联合IL-1β和ox-LDL作用于成纤维细胞,并应用Sim干预上述因子,探讨Sim对上述因子作用下的心肌成纤维细胞增殖、胶原的合成和降解的影响。结果分述如下:第一部分:IL-1β对心肌成纤维细胞合成和降解胶原的影响方法:体外培养乳鼠心肌成纤维细胞。加入IL-1β（0.01 ng/ml、0.1 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、100ng/ml）干预24h后,观察细胞形态,MTT法观察细胞增殖情况,3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法观察细胞DNA合成,3H-脯氨酸（3H-Pro）掺入法观察胶原的合成。明教酶谱法观察MMPs活性,Western-blot观察MMP-2和MMP-9的蛋白表达,RT-PCR观察MMP-2和MMP-9的mRNA表达。结果:1.IL-1β作用于心肌成纤维细胞24h后,0.01 ng/ml IL-1β对细胞增殖、DNA的合成没有明显影响。0.1ng/ml IL-1β可显著性抑制细胞活性及减少3H-TdR掺入量（P＜0.05）。随着浓度增高,上述抑制作用逐渐增强,1～100 ng/ml较0.1ng/ml组抑制作用明显增强（P＜0.05）。2.0.01ng/ml IL-1β干预24h后对CFs合成胶原无明显影响。随着浓度的升高,0.1ng/ml IL-1β即可显著性抑制细胞胶原的合成（P＜0.05）。1～100 ng/ml IL-1β抑制细胞胶原合成的作用更强（P＜0.01）,但10～100 ng/ml之间作用无显著性差异。3.小剂量的IL-1β干预后,MMP-2的活性即升高,并呈浓度依赖性增高趋势。同时MMP-9的活性也显著性增高,与MMP-2不同,0.01～1ng/ml IL-1β作用后MMP-9的升高程度无显著性差异。4.与空白对照组比较,IL-1β干预后可显著性升高MMP-2蛋白表达水平,按0.01～0.1ng/ml分别升高1.35倍和1.56倍（P＜0.05）,1～100ng/ml分别升高2.15倍、2.34倍、2.41倍（P＜0.01）。MMP-9蛋白表达也显著性升高,按0.01ng/ml即可显著性升高MMP-9蛋白表达1.38倍（P＜0.05）,0.1～100ng/ml分别2.37倍、2.56倍、2.60倍、2.67倍（P＜0.01）。5.IL-1β作用于CFs 24小时后能浓度依赖性增加MMPs mRNA表达。与空白对照组比较,MMP-2 mRNA表达能显著性增加,按0.01ng/ml～100ng/ml不同浓度分别升高1.81倍（P＜0.05）、2.17倍、2.18倍、2.27倍、2.31倍（P＜0.01）。MMP-9 mRNA表达也能显著性升高,分别1.36倍（P＜0.05）、1.49倍、1.50倍、1.51倍、1.52倍（P＜0.01）。结论:一定浓度的IL-1β抑制CFs的增殖及DNA的合成,并可能通过该作用降低胶原的合成,同时IL-1β还能增加MMPs的活性,起到降解胶原的作用。上述作用呈浓度依赖性,与心肌梗死面积越大,炎症因子浓度越高,心室重构越严重相符合,提示IL-1β在心室重构过程中起一定的作用。第二部分:氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）对心肌成纤维细胞合成和降解胶原的影响方法:分离并氧化低密度脂蛋白。体外培养乳鼠心肌成纤维细胞,加入ox-LDL（10、20、50、100μg/ml）干预24 h,观察细胞形态,3H-TdR掺入法观察细胞DNA合成,3H-Pro掺入法观察细胞胶原的合成,明胶酶谱法测定基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9活性,Western-blot检测MMP-2和MMP-9蛋白表达水平,RT-PCR检测MMP-2、MMP-9的mRNA表达。结果:1.ox-LDL对细胞3H-TdR掺入率的影响与其浓度密切相关。用ox-LDL干预24h后可见10μg╱ml和20μg╱ml即显著性增加细胞3H-TdR掺入率（P＜0.05）,随着浓度的增高（50～100μg/ml）,掺入率也随之增高（P＜0.01）,100μg/ml的增强作用最强。2.ox-LDL对细胞3H-Pro掺入率的影响也与其浓度密切相关。用ox-LDL干预24h后可见10μg/ml即显著性减少细胞3H-Pro掺入率（P＜0.05）,而随着浓度的增高（20～100μg/ml）,掺入率也迅速降低（P＜0.01）,100μg╱ml的抑制作用最强。3.ox-LDL干预24小时后能增加条件培养基中MMP-2和MMP-9的活性。与空白对照组相比,ox-LDL干预后可显著性增加细胞MMP-2活性（P＜0.05）,但各剂量组之间无显著性差异。10μg/ml ox-LDL作用于CFs后,MMP-9的活性轻微增高,但无显著性差异;随浓度的升高,MMP-9的活性也显著性增高（P＜0.05）。4.与空白对照组比较,10μg/ml的ox-LDL即能显著性升高MMP-2蛋白表达1.17倍（P＜0.05）,而20～100μg╱ml作用更强并呈浓度依赖性,分别升高1.32倍、1.42倍、1.53倍（P＜0.01）。10μg/mL ox-LDL不影响MMP-9蛋白的表达;20μg/ml ox-LDL能使MMP-9蛋白表达显著性升高1.17倍（P＜0.05）,而50～100μg/ml ox-LDL作用更强,分别使MMP-9蛋白升高1.39倍和1.52倍（P＜0.01）。5.10～20μg/ml ox-LDL使MMP-2 mRNA表达分别升高1.01倍、1.07倍。而50～100μg/ml ox-LDL则使MMP-2 mRNA表达分别升高1.21倍、1.33倍,与前两组和对照组比较,呈明显上升趋势。与对照组比较,10～20μg/ml ox-LDL干预细胞24h后,对细胞MMP-9的mRNA表达无显著性影响,而50μg/ml和100μg/ml ox-LDL则显著性升高MMP-9的mRNA表达1.18倍和1.22倍（P＜0.05）。结论:高剂量的ox-LDL作用于心肌成纤维细胞后,能促进细胞DNA合成,但减少细胞合成胶原并增加MMP-2和MMP-9的活性和mRNA表达。但低剂量的ox-LDL对mRNA的影响不大。提示ox-LDL可能使CFs变性,导致胶原合成减少。高剂量时能通过转录前和转录后水平影响MMPs分泌,而低剂量时只能通过转录后水平促进MMPs分泌,从而增加胶原的分解,促进心室重构的发生。第三部分:辛伐他汀（Sim）干预IL-1和ox-LDL对心肌成纤维细胞合成和降解胶原的影响方法:分离并氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）。体外培养乳鼠心肌成纤维细胞,设立空白对照组、IL-1β组（10ng/ml）、Sim（10μmol/L）+IL-1β组（10ng/ml）、ox-LDL组（50μg/ml）、Sim（10μmol/L）+ox-LDL组（50μg/ml）、ox-LDL（50μg/ml）+IL-1β（10ng/ml）组、Sim（10μmol/L）+ox-LDL（50μg/ml）+IL-1β（10ng/ml）组。干预24 h,观察细胞形态,3H-TdR掺入法观察细胞DNA合成,3H-Pro掺入法观察胶原的合成,明胶酶谱法测定基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9活性,Western-blot检测MMP-2和MMP-9蛋白表达水平,RT-PCR检测MMP-2、MMP-9的mRNA表达。结果:1.与对照组比较,IL-1β能使CFs的3H-TdR掺入率明显降低（P＜0.05）,而ox-LDL使CFs3H-TdR掺入率显著性升高（P＜0.05）;IL-1β+ox-LDL组也明显降低3H-TdR掺入率（P＜0.05）,且与ox-LDL单独作用相比较,有显著性差异（P＜0.01）。应用Sim干预后,能改善IL-1β或ox-LDL对细胞DNA的影响,与对照组比较无明显区别。而IL-1β+ox-LDL+Sim组与IL-1β+ox-LDL组相比,明显增加细胞DNA合成,与对照组比较无明显差异。2.与对照组相比,IL-1β和ox-LDL单独作用时均能使CFs3H-Pro掺入率显著性降低（P＜0.01）;IL-1β+ox-LDL协同作用能使胶原的合成进一步降低（P＜0.01）,而且其与IL-1β组相比也有显著性差异（P＜0.05）。用Sim干预后,各组细胞胶原合成能力得到明显改善（P＜0.05）,但均未达到对照组水平。3.IL-1β和ox-LDL单独作用细胞后均能使MMP-2活性明显升高（P＜0.01）。两者联合应用后,使得MMP-2活性更进一步升高（P＜0.01）。用Sim干预后,能显著性降低IL-1β和ox-LDL单独作用对MMP-2的影响（P＜0.05）,且与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）;还可显著性抑制IL-1β和ox-LDL协同产生的作用（P＜0.01）,但未能到达对照组水平（P＜0.05）。与对照组相比,IL-1β和ox-LDL单独作用细胞后均能使MMP-9活性明显升高（P＜0.05）。两者联合应用后,发挥协同作用,使得MMP-9活性进一步升高（P＜0.01）,但与单因素作用相比,无显著性差异。用Sim干预后,能显著性降低上述因素对MMP-9的影响（P＜0.05）,其中IL-1β+Sim组和ox-LDL+Sim组与对照组比较无显著性差异,IL-1β+ox-LDL+Sim组则部分降低两者作用,但未能到达对照组水平。4.与空白对照组比较,IL-1β和ox-LDL单独干预细胞24h后,即能显著性升高MMP-2蛋白的表达,分别升高1.59倍和1.23倍（P＜0.01）,两者协同作用后,可使MMP-2水平进一步升高到1.74倍,且与单因素作用组相比有显著性差异（P＜0.05）。用Sim干预后,均能显著性降低上述因素对MMP-2的影响。1L-1β+Sim组升高1.23倍,与IL-1β组相比,显著降低MMP-2蛋白水平（P＜0.05）;ox-LDL+Sim组升高1.23倍,与ox-LDL组相比,也显著降低MMP-2蛋白水平（P＜0.05）;IL-1β+ox-LDL+Sim组升高1.37倍,与IL-1β+ox-LDL组相比,显著降低MMP-2蛋白水平（P＜0.01）。但均未能恢复对照组水平（P＜0.05）。与空白对照组比较,IL-1β和ox-LDL也能显著性升高条件培养基中MMP-9蛋白的表达（分别升高1.71倍和1.48倍,P＜0.01）,两者协同作用后,MMP-9水平进一步升高为1.72倍（P＜0.01）,且与ox-LDL单独作用相比,有显著差异（P＜0.05）,但与IL-1β单独作用相比,无明显差异。用Sim干预后,能显著性降低上述因素对MMP-9的影响。IL-1β+Sim组（升高1.18倍）与IL-1β组相比,ox-LDL+Sim组升高（1.20倍）与ox-LDL组相比,IL-1β+ox-LDL+Sim组（升高1.43倍）与IL-1β+ox-LDL组相比,均显著降低MMP-9蛋白水平,但与对照组比较,未能恢复正常水平。5.与空白对照组比较,IL-1β和ox-LDL单独干预细胞后,均能显著性升高条件培养基中MMP-2 mRNA的表达（分别升高1.57倍和1.37倍）,且IL-1β组升高程度较高（P＜0.01）。两者协同作用后,MMP-2 mRNA水平进一步升高至1.68倍（P＜0.01）,与ox-LDL单独作用相比,有显著性差异,但与IL-1β单独作用相比,无明显差异。用Sim干预后,能显著性降低上述因素对MMP-2 mRNA的影响。IL-1β+Sim组（升高1.24倍）与IL-1β组相比,ox-LDL+Sim组（升高1.08倍）与ox-LDL组相比,IL-1β+ox-LDL+Sim组（升高1.34）倍与IL-1β+ox-LDL组相比,显著降低MMP-2 mRNA水平（P＜0.05）。除ox-LDL+Sim组外,其余两组与对照组比较,均未能恢复对照组水平。IL-1β和ox-LDL单独干预细胞24h后,均能显著性升高条件培养基中MMP-9 mRNA的表达,且IL-1β升高程度较高（IL-1β组升高1.50倍,P＜0.01;ox-LDL组升高1.27倍,P＜0.05）;两者协同作用后,MMP-9 mRNA水平进一步升高（1.64倍,P＜0.01）。与ox-LDL组相比较,作用有显著性差异（P＜0.05）,但与IL-1β组相比,无明显差异。用Sim干预后,能显著性降低上述因素对MMP-9 mRNA的影响。ox-LDL+Sim组升高1.10倍,与ox-LDL组相比,显著降低MMP-9 mRNA水平（P＜0.05）,且恢复至对照组水平;IL-1β+Sim组干预后升高1.19倍,与IL-1β组相比,显著降低MMP-9 mRNA水平（P＜0.05）,但未能恢复至对照组水平;IL-1β+ox-LDL+Sim组升高1.31倍,与IL-1β+ox-LDL组相比,同样显著降低MMP-9 mRNA水平（P＜0.05）,也未能恢复对照组水平（P＜0.05）。结论:IL-1β和ox-LDL联合作用后,可抑制CFs DNA的合成,降低胶原的合成,并通过转录前和转录后水平调节MMPs,增加MMP-2和MMP-9 mRNA、蛋白的表达及生物活性,起到降解胶原的作用。Sim不仅能改善IL-1β和ox-LDL单独作用时对细胞胶原合成和降解的影响,也可改善两者联合应用后的影响。提示MI后的心室重构是多因素作用的结果,早期应用他汀类药物能改善心室不良重构。
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