呼吸道合胞病毒G蛋白亚单位粘膜疫苗的研究

论文摘要

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）是世界范围内引起婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体之一，全球每年有近四百万儿童受其感染，给人们造成了巨大的财产损失和精神痛苦，目前还没有一种安全有效的疫苗问世。本研究首次通过替换G蛋白的CX3C模序来降低肺部嗜酸性粒细胞的数目，通过改造过的G蛋白与粘膜佐剂LT物理混合后免疫小鼠，增强疫苗在呼吸道的sIgA，来增强疫苗免疫的效果。人工合成G蛋白基因的部分核酸序列，并通过PCR将其中所存在的CX3C模序替换为RSV M蛋白上的CTL表位，构建表达载体G／pET22b和改造过的G（CTL）／pET22b，转入大肠杆菌BL21（DE3）中，G蛋白和G（CTL）蛋白在大肠杆菌中均有高效表达。在37℃下诱导的蛋白占总蛋白的30％以上。应用His-Tag与金属离子的亲和力对目的蛋白进行了纯化，纯度大于92％。用纯化的目的蛋白与无毒型菌热不稳定肠毒素（LT）进行物理混合后进行免疫，分别设立A：PBS；B：LT；C：G（CTL）蛋白+LT；D：G蛋白（含CX3C）。共四组，分别在0、1、4周进行免疫。免疫后，针对血清中IgG、IgA和呼吸道上的sIgA及嗜酸性粒细胞的数量进行测定。结果表明：C组和D组小鼠血清中IgG明显高于A组和B组，几何平均滴度分别为1995.26和1584.89。IgA只出现在C组的血清和呼吸道中，几何平均滴度分别为1781.23和3.167，而在A、B、D组都没有；C组小鼠血清和呼吸道内的嗜酸性粒细胞的数目与A组没有显著性的差异，但D组的嗜酸性粒细胞数目明显高于其它两组。本研究成功地表达了RSV G蛋白和G（CTL）蛋白，对其进行纯化，并对疫苗样品的免疫原性进行测定。针对G蛋白CX3C模序的改造使肺内嗜酸性粒细胞的数量相比对照组没有增加。通过G蛋白与粘膜佐剂LT混合后免疫小鼠，不仅提高了小鼠血清中的抗体滴度，而且还使血清和呼吸道中IgA的分泌增加，增强疫苗的粘膜免疫效果。呼吸道合胞病毒G蛋白亚单位粘膜疫苗的成功构建，将为RSV疫苗的开发开辟一条新的途径，为进一步研究G蛋白在RSV的致病机理中的作用和研制RSV疫苗奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 呼吸道合胞病毒研究进展
• 1.1 呼吸道合胞病毒简介
• 1.2 RSV的病毒学特性
• 1.3 G蛋白
• 1.3.1 G蛋白的结构
• 1.3.2 G蛋白上的表位
• 1.3.3 CX3C模序
• 1.4 呼吸道合胞病毒的流行病学
• 1.5 呼吸道合胞病毒的相关疾病
• 1.6 呼吸道合胞病毒疫苗的研究进展
• 1.6.1 福尔马林减毒RSV疫苗
• 1.6.2 减毒活疫苗
• 1.6.4 DNA疫苗
• 1.6.5 载体递药系统
• 1.6.6 结束语
• 第二章 研究的目的及意义
• 第三章 表达载体G/pET22b和G（CTL）/pET22b的构建
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 G/pET22b和G（CTL）/pET22b表达载体构建路线
• 3.2.2 PCR扩增G蛋白基因片段
• 3.2.3 利用PCR技术对G蛋白进行改造
• 3.2.4 菌落PCR鉴定
• 3.2.5 重组质粒的酶切鉴定
• 3.2.6 G蛋白基因序列的测序确认
• 3.2.7 菌落PCR鉴定G/pET22b/DH5α和G（CTL）/pET22b/DH5α
• 3.2.8 重组质粒G/pET22b和G（CTL）/pET22b的酶切鉴定
• 3.3 讨论
• 3.3.1 RSV G蛋白
• 3.3.2 CTL表位的设计
• 3.3.3 通过重组PCR定点突变法对G蛋白基因进行改造
• 3.3.4 Th1和Th2型反应与RSV的病理学机制
• 3.4 小结
• 第四章 目的蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 重组G蛋白和G（CTL）的表达
• 4.2.2 G蛋白的免疫学活性检测
• 4.2.3 金属离子对His-tag标签蛋白亲和纯化效果的比较及目的蛋白纯化
• 4.3 讨论
• 4.3.1 表达载体的选取
• 4.3.2 重组质粒G/pET22b和G（CTL）/pET22b的构建
• 4.3.3 重组融合蛋白G在大肠杆菌中的高效表达
• 4.3.4 Western blotting检测结果
• 4.3.5 纯化标签的使用
• 4.3.6 金属离子的选取
• 4.4 小结
• 第五章 疫苗样品免疫原性的测定
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 考马斯亮蓝标准曲线及抗原定量
• 5.2.2 小鼠免疫及免疫后小鼠的行为观察
• 5.2.3 免疫后不同时间的小鼠血清中G蛋白特异性IgG的含量
• 5.2.4 免疫后不同时间的小鼠血清中的G蛋白特异性IgA水平
• 5.2.5 免疫后不同时间的小鼠呼吸道中G蛋白特异性IgA的含量
• 5.2.6 小鼠血液中和呼吸道灌洗液中嗜酸性粒细胞的数量
• 5.3 讨论
• 5.3.1 佐剂的选取
• 5.3.2 趋化因子CX3C对嗜酸性粒细胞的影响
• 5.3.3 几何平均滴度
• 5.3.4 疫苗的免疫原性
• 5.4 小结
• 第六章 全文总结
• 第七章 展望
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介