三种激发子诱导的过敏性细胞死亡和气孔关闭的分子机制研究

论文摘要

植物病原菌产生的激发子和病程相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMP）是一类重要的信号分子,模仿非亲和互作中植物与病原菌的信号交流,启动不同的级联信号途径,诱发植物的抗病性,导致过敏反应（hypersensitive response,HR）和气孔关闭。本研究采用病毒诱导基因沉默（virus inducing gene silencing, VIGS）技术研究了本氏烟（Nicotiana benthamiana）NADPH氧化酶（respiratory burst oxidase homologues, RBOH）、液泡加工酶（vacuolar processing enzyme, VPE）、异三聚体G蛋白（简称G蛋白）及丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）在不同来源的激发子（harpin、Nep1和boehmerin）诱发的过敏反应和气孔关闭中的功能,这些激发子分别是细菌（Xanthomonas oryzae）、真菌（Magnaporthe oryzae）和卵菌（Phytophthora boehmeriae）的PAMPs.试验证明（?）BOH、VPE和G蛋白参与3种激发子诱导的气孔关闭,MAPKKKa-MEK2-WIPK介导激发子Nep1诱发的HR,而Gα、Gβ2和VPEla参与harpin诱导的HR,表明不同激发子诱发的信号传导途径具有一定保守性,同时不同的激发子诱导的信号传导也存在特异性。RBOH是最重要的活性氧（active oxygen species, AOS）来源之一。NbrbohA、NbrbohB单基因沉默,以及NrbohA和NbrbohB双基因沉默显著抑制了boehmerin、INF1和harpin等3种激发子诱发的叶片中H2O2积累,但不影响激发子诱导的HR,且基因沉默对激发子诱发的PR基因的转录没有影响；而这些基因沉默却抑制激发子诱导的气孔关闭,且保卫细胞内NO积累显著减少,但不影响保卫细胞内Ca2+浓度和AOS积累。说明RBOH参与激发子诱导的气孔关闭,但不参与激发子诱导的过敏反应和PR基因的转录；植物体内其它酶催化产生的AOS及AOS/NO平衡可能参与激发子诱发的过敏性细胞死亡。VPE是植物液泡的半胱氨酸蛋白酶,具有类似动物caspases-1-like酶活性。本试验发现NbVPE1a和NbVPE1b单基因沉默,及NbVPE1a/1b双基因沉默不影响harpin、boehmerin和Nep1激发子诱发的H2O2积累,NbVPE1a和NbVPE1a/1b沉默却抑制了harpi（?）诱发的HR；而boehmerin和Nep1均可诱发这3种VPE沉默的植株产生正常的HR,表明harpir诱发的HR依赖于VPE,但是VPE不参与boehmerin和Nep1诱发的HR。单基因和双基因沉默均抑制3种激发子诱发的气孔关闭,且抑制了保卫细胞内NO的积累；3种激发子诱导处理后,单基因沉默植株叶片中保卫细胞内活性氧的积累与对照一致,但是双基因沉默植株中保卫细胞内AOS的量显著高于对照和单基因沉默植株中保卫细胞内AOS的量,表明双基因共同作用负调控保卫细胞内AOS的积累。进一步转录分析显示VPE调节了活性氧相关的基因（NbrbohB）和转录因子（WRKY2）的转录。而已证明气孔在植物免疫中具有重要功能,提示VPE参与PAMP触发的抗性（PAMP-triggered immunity,PTI）.G蛋白连接着细胞表面的受体和下游的效应因子,在植物多种信号途径中具有重要的作用。本研究克隆了N.benthamiana G蛋白Gα、Gβ1和Gβ2等基因及腺苷酸环化酶基因（adenylyl cyclase,AC）,Gα和Gβ2沉默抑制细菌蛋白激发子harpin诱导的过敏反应;Gα、Gβ2、AC削弱了3种激发子诱发的H2O2积累。Gα、Gβ1、Gβ2沉默抑制激发子诱发的气孔关闭,且保卫细胞中NO的积累减少。但是AC因沉默对3种激发子诱发过敏反应和气孔关闭及保卫细胞内NO的积累均没有影响。结果表明G蛋白的Gα、Gβ亚基在不同激发子激发过敏反应和气孔关闭及NO和H2O2积累中作用存在差异。MAPK信号级联途径包含三个保守的激酶,MAPK kinase kinase（MAPKKK或MEKK）磷酸化MAPK kinase（MAPKK或MEK）又磷酸化MAPK,调节荷尔蒙和其它环境刺激或外源信号。MAPKKKα.MEK2和WIPK沉默烟草抑制了Nep1诱导的HR；MEK1、SIPK和NTF6沉默的本氏烟不影响harpin、Nep1和boehmerin诱导的HR.Nep1处理的基因沉默植株内,转录因子（WRKY2）和防卫基因（PR2b）的表达受抑制。WRKY2沉默后也抑制了Nep1诱导的HR,但不影响boehmerin和harpin诱导的HR。另外,MEK2-NTF6调节激发子诱导的H2O2积累；MEK2-WIPK调节Nep1诱导的NO积累,SIPK沉默削弱了激发子诱导的保卫细胞内NO积累。基因沉默烟草不影响激发子诱导的保卫细胞内Ca2+浓度和AOS积累。结果表明,MAPKKKα、MEK1、MEK2、WIPK、SIPK、NTF6和WRKY2参与调节激发子信号。综上,RBOH.VPE.G蛋白及MAPK调节激发子诱发的信号传递,揭示了不同激发子信号的保守性及复杂性。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 上篇 文献综述
• 第一章 激发子诱发的非寄主抗性
• 1 植物-微生物互作中MAMP触发抗性的诱发和抑制
• 1.1 Pattern识别受体在植物的先天免疫中的功能
• 1.2 效应因子抑制病原诱发的早期抗性
• 2 激发子信号
• 2.1 蛋白激酶及蛋白的磷酸化与植物的防卫反应
• 2.2 离子通道与植物的防卫反应
• 2.3 NO和AOS与植物的防卫反应
• 参考文献
• 第二章 保卫细胞信号传导
• 1 气孔运动的机制
• 2 保卫细胞信号
• 2.1 受体识别
• 2.2 Lipid
• 2.3 AOS
• 2.4 NO
• 3 蓝光和其它环境因素对气孔的影响
• 参考文献
• 第三章 病毒诱导基因沉默技术在植物功能基因组研究中的应用
• 1 VIGS:植物功能基因组的革新
• 1.1 VIGS技术的发展
• 1.2 VIGS技术的改进
• 1.3 VIGS的方法
• 1.4 本氏烟（Nicotiana benthamiana）是研究植物与病原互作的模式植物
• 2 VIGS和其它功能基因研究方法的比较
• 2.1 VIGS快速
• 2.2 VIGS不需要植物转化
• 2.3 VIGS克服基因的冗余
• 2.4 VIGS能快速地对不同植物中相同基因的功能进行比较
• 2.5 VIGS的局限性
• 参考文献
• 下篇 研究内容
• 第一章 NADPH氧化酶在激发子诱发的过敏反应和气孔关闭中的功能研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果和分析
• 2O₂积累'>2.1 NbrbohA和NbrbohB参与激发子诱导的H₂O₂积累
• 2.2 RBOH不参与激发子诱导的过敏反应
• 2.3 RBOH沉默不影响激发子诱发的PR基因表达
• 2.4 Nbrboh沉默抑制激发子诱导的气孔关闭
• 2.5 NO参与激发子诱导的气孔关闭
• 2+]_cyt变化'>2.6 RBOH沉默不影响激发子诱发的[Ca²⁺]_cyt变化
• 2O₂和NO之外的AOS不参与激发子诱导的气孔关闭,但参与过敏反应'>2.7 H₂O₂和NO之外的AOS不参与激发子诱导的气孔关闭,但参与过敏反应
• 3 讨论
• 2O₂积累'>3.1 RBOH参与激发子诱导的H₂O₂积累
• 3.2 RBOH不参与激发子诱发的过敏反应
• 2+作用于RBOH的上游'>3.3 Ca²⁺作用于RBOH的上游
• 2O₂和NO的积累,抑制激发子诱导的气孔关闭,但不影响HR'>3.4 RBOH沉默影响H₂O₂和NO的积累,抑制激发子诱导的气孔关闭,但不影响HR
• 参考文献
• 第二章 液泡加工酶（VACUOLAR PROCESSING ENZYME,VPE）在激发子诱发的过敏反应和气孔关闭中的功能研究
• 1 材料和方法
• 1.1 植物材料、激发子的准备及激发子处理植物
• 1.2 重组的马铃薯X病毒载体pgR107
• 1.3 农杆菌菌株
• 1.4 载体构建及农杆菌侵染烟草
• 1.5 DAB染色
• 1.6 烟草总RNA的提取及反转录PCR反应（reverse transcriptase polymerase chainreaction,RT-PCR）
• 1.7 气孔开度测量
• 1.8 保卫细胞中NO和AOS测量
• 2 结果和分析
• 2.1 NbVPE1a和NbVPE1a/lb沉默抑制harpin诱导的HR
• 2O₂产生'>2.2 NbVPE不参与激发子诱导的H₂O₂产生
• 2.3 NbVPE沉默抑制激发子诱导的气孔关闭
• 2.4 Nb VPE沉默抑制激发子诱导的NO产生
• 2.5 NbVPE1a/1b双沉默负调控激发子诱导的AOS产生
• 2.6 NbVPE1a/1b沉默影响活性氧相关的基因（NbrbohB）和转录因子（WRKY2）的转录
• 3 讨论
• 3.1 NbVPE1a参与harpin诱导的HR,不参与boehmerin和Nep1诱导的HR
• 2O₂积累、激发子诱导的过敏反应的关系'>3.2 NbVPE和H₂O₂积累、激发子诱导的过敏反应的关系
• 3.3 NbVPE依赖的NO积累参与激发子诱导的气孔关闭
• 3.4 NbVPE调节基因的转录
• 参考文献
• 第三章 异三聚体G蛋白在激发子诱发的过敏反应和气孔关闭中的功能研究
• 1 材料和方法
• 1.1 植物材料、激发子的准备及激发子处理植物
• 1.2 重组的马铃薯X病毒载体pgR107
• 1.3 农杆菌菌株
• 1.4 载体构建及农杆菌侵染烟草
• 1.5 DAB染色
• 1.6 烟草总RNA的提取及反转录PCR反应（reverse transcriptase polymerase chainreaction,RT-PCR）
• 1.7 气孔开度测量
• 1.8 保卫细胞中NO和AOS测量
• 2 结果和分析
• 2.1 N.benthamiana Gα、Gβ1、Gβ2和AC基因的克隆
• 2.2 Ga、Gβ2沉默抑制harpin诱导的过敏反应
• 2O₂积累'>2.3 Ga、Gβ2和AC沉默植株削弱激发子诱导的H₂O₂积累
• 2.4 Ga、Gβ1和Gβ2沉默抑制激发子诱导的气孔关闭
• 2.5 Ga、Gβ1和Gβ2沉默抑制激发子诱导的NO积累
• 2.6 Ga、Gβ1、Gβ2和AC沉默差异地调节不同激发子诱导的AOS积累
• 2.7 与植物防卫、AOS平衡、转录相关的基因转录分析
• 3 讨论
• 3.1 异三聚体G蛋白（Gα、Gβ）正调控激发子诱发的气孔关闭
• 3.2 Gα和Gβ2参与对细菌蛋白诱导的过敏反应
• 3.3 异三聚体G蛋白依赖的NO积累参与激发子诱导的气孔关闭
• 3.4 AC可能不是一个重要的下游效应因子参与植物的防卫
• 3.5 植物的异三聚体G蛋白信号的复杂性
• 参考文献
• 第四章 MAPK级联途径在激发子诱发的过敏反应中的功能研究
• 1 材料和方法
• 1.1 植物材料、激发子的准备及激发子处理植物
• 1.2 重组的马铃薯X病毒载体pgR107
• 1.3 农杆菌菌株
• 1.4 载体构建及农杆菌侵染烟草
• 1.5 DAB染色
• 1.6 烟草总RNA的提取及反转录PCR反应（reverse transcriptase polymerase chainreaction,RT-PCR）
• 1.7 保卫细胞中NO、AOS测量
• 2+测量'>1.8 保卫细胞中Ca²⁺测量
• 2 结果和分析
• 2.1 MAPKKKα、MEK1、MEK2、WIPK、SIPK和NTF6沉默载体构建
• 2.2 MAPKKKα-MEK2-WIPK级联途径介导Nep1诱导的HR,不参与boehmerin和harpin诱导的HR
• 2O₂积累'>2.3 MEK2-NTF6级联途径参与激发子诱导的H₂O₂积累
• 2.4 MEK2和WIPK参与Nep1诱导的保卫细胞中NO积累
• 2+]_cyt和AOS积累'>2.5 MAPKKKα、MEK1、MEK2、WIPK、SIPK和NTF6沉默不影响激发子诱导的保卫细胞内[Ca²⁺]_cyt和AOS积累
• 2.6 与植物防卫、AOS平衡、转录相关的基因转录分析
• 2.7 WRKY2参与Nep1诱导的HR,不参与boehmerin和harpin诱导的HR
• 3 讨论
• 3.1 MAPK级联途径参与植物的防卫反应是外源刺激物依赖的
• 2O₂积累和过敏反应'>3.2 MAPK级联途径调控Nep1诱导的H₂O₂积累和过敏反应
• 2O₂积累的交叉'>3.3 MAPK级联途径与NO和H₂O₂积累的交叉
• 3.4 Nep1诱导的MAPK信号调节转录因子WRKY2的转录
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 本论文创新点
• 攻读博士学位期间发表的研究论文
• 致谢