骨髓间充质干细胞对1型糖尿病大鼠淋巴细胞免疫调节作用的实验研究

论文摘要

糖尿病是由遗传因素、环境因素、免疫功能紊乱等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪等一系列代谢紊乱综合征。糖尿病主要分为1型糖尿病和2型糖尿病。1型糖尿病是由T细胞介导的特异性破坏胰岛β细胞的进行性自身免疫性疾病。注射外源性胰岛素和口服降糖药物是目前主要的治疗方法,但是其对血糖的控制均不理想,无法阻止糖尿病眼病、肾病等慢性并发症的发生和发展。2000年Edmonton方案的确立使利用胰岛移植治疗胰岛素依赖型糖尿病取得突破性进展,但供体的短缺以及严重的免疫排斥使其难以广泛开展。近年来,应用干细胞和基因疗法治疗糖尿病成为糖尿病治疗领域的研究热点。骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中的一种具有自我更新和多向分化能力的多功能非造血干细胞,因其来源广泛,取材方便,扩增迅速,可塑性强,具有独特的免疫调节作用,在特定条件下可分化为脂肪细胞,软骨细胞,血管内皮细胞等,被认为是最有前途的组织工程种子细胞之一。MSCs具有独特的免疫调节特性和极低的免疫原性,新近的研究表明,CD4+CD25+Tregs是MSCs发挥免疫调节作用的重要的效应细胞。另一方面,CD4+CD25+Tregs数量的缺失和功能的异常与T1DM的发生、发展密切相关,在动物模型中过继转移CD4+CD25+Tregs可以阻止T1DM的发生和发展。由于MSCs极强的可塑性和独特的免疫调节功能,使其极有可能成为细胞替代疗法治疗1型糖尿病的一种新细胞源。本研究的目的是:从体外和体内探讨MSCs对T1DM大鼠淋巴细胞的免疫调节作用,以及联合MSCs及其来源的IPCs移植治疗T1DM大鼠,观察MSCs对T1DM大鼠调节性T细胞的影响和受体淋巴细胞活化、增殖能力的影响,以及相关淋巴组织因子的状态,从机体免疫状态的变化等方面探讨MSCs降低血糖的机制。大鼠MSCs的体外培养和鉴定:通过全骨髓贴壁法,利用MSCs易于贴壁生长的特性,使MSCs逐渐得到纯化。通过细胞形态学观察,细胞表面标志物,诱导分化能力三个方面鉴定MSCs。结果显示:3代MSCs多成长梭形,生长均匀,形态趋向一致;MSCs表面标记高表达CD29、CD90、CD106,低表达造血干细胞标记物CD34、CD45,表达率分别为98.6%、99.7%、51.0%、1.8%和5.0%;在体外能成功的将MSCs诱导成脂肪细胞,并通过油红染色鉴定。结论:采用全骨髓贴壁法可以获得生长迅速,扩增快和纯度高的MSCs。骨髓间充质干细胞体外对1型糖尿病大鼠淋巴细胞的免疫调节作用:取第3代MSCs与T1DM大鼠淋巴细胞体外共培养,实验分为5组,分别是A组（淋巴细胞,空白组）;B组（淋巴细胞+PHA,增殖组）;C组（淋巴细胞/MSCs: 1:1+PHA）;D组（淋巴细胞/MSCs: 10:1+PHA）;E组（淋巴细胞/MSCs: 100:1+PHA）,共培养72h后,MTT法观察MSCs对淋巴细胞增殖能力的影响,流式细胞仪检测共培养体系中淋巴细胞凋亡、周期水平以及CD4+CD25+调节性T细胞比例。结果显示:MSCs对PHA刺激诱导的淋巴细胞增殖有抑制作用,以淋巴细胞:MSCs为1:1时（C组）抑制作用最强;共培养体系中,大部分淋巴细胞处于G0/G1期;C组淋巴细胞凋亡水平（58.05±0.89）%显著高于对照组（43.35±0.86）%（P<0.05）;CD4+CD25+Tregs的比例C组（22.76±1.15）%显著高于对照组（5.80±0.68）%（P<0.05）。结论:MSCs体外可显著抑制PHA刺激的T1DM大鼠淋巴细胞的增殖,使淋巴细胞凋亡水平升高,大部分淋巴细胞处于G0/G1期,其免疫调节作用与CD4+CD25+Tregs比例增高密切相关。骨髓间充质干细胞及其来源的产胰岛素细胞移植对1型糖尿病大鼠淋巴细胞的免疫调节作用:通过模拟组织微环境体外将MSCs诱导为IPCs,利用腹腔注射STZ诱导大鼠T1DM模型,联合MSCs及其来源的IPCs移植治疗T1DM大鼠,观察MSCs对T1DM大鼠调节性T细胞的影响和受体淋巴细胞活化、增殖能力的影响,以及相关淋巴组织因子血清IL-6,IL-10,INF-γ,TGF-β1水平。结果显示:联合MSCs和IPCs移植治疗T1DM大鼠疗效最好,IPCs可以迅速降低T1DM大鼠的血糖,而MSCs可以纠正TIDM大鼠体内失衡的细胞因子状态,并促进CD4+CD25+FOXP3+Tregs比例增高,从而改善机体内的免疫失衡状态。结论:通过模拟组织微环境将MSCs诱导为IPCs,IPCs可以作为短缺的胰岛供体的新来源,有效快速的降低血糖,同时联合应用MSCs移植治疗T1DM,调整受体的免疫失衡状态,可以保护新生的胰岛和自身残留的胰岛免受自身反应性T细胞的攻击。综上所诉,采用全骨髓贴壁法可以获得生长迅速,扩增快和纯度高的MSCs。通过模拟组织微环境在体外将MSCs诱导为IPCs,单独移植IPCs或MSCs都不足以治愈T1DM大鼠,而联合MSCs和IPCs移植治疗T1DM大鼠疗效最好,IPCs可以迅速降低T1DM大鼠的血糖,而MSCs可以纠正T1DM大鼠体内失衡的细胞因子状态,并促进CD4+CD25+FOXP3+Tregs比例增高,从而改善机体内的免疫失衡状态。虽然MSCs在安全有效的应用到临床治疗前还有许多的障碍需要克服,但由于其极强的可塑性和独特的免疫调节功能,使其极有可能成为细胞替代疗法治疗1型糖尿病的一种新细胞源。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 第一部分 MSCs 的生物学特性研究进展
• 第二部分 调节性T 细胞与1 型糖尿病的研究进展
• 第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定
• 1 引言
• 2 实验材料
• 3 实验方法
• 4 实验结果
• 5 讨论
• 附图
• 第二部分 骨髓间充质干细胞体外对1 型糖尿病大鼠淋巴细胞的免疫调节作用
• 1 引言
• 2 实验材料
• 3 实验方法
• 4 实验结果
• 5 讨论
• 附图
• 第三部分 骨髓间充质干细胞及其来源的产胰岛素细胞移植对1 型糖尿病大鼠淋巴细胞的免疫调节作用
• 1 引言
• 2 实验材料
• 3 实验方法
• 4 实验结果
• 5 讨论
• 附图
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢