猪繁殖与呼吸综合征病毒间接ELISA抗体检测方法的建立及Nsp2单克隆抗体的制备

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种主要以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。自1987年报道于美国南部,现已造成了世界各地的大范围流行,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。2006年,在我国猪群内暴发了一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的猪的疾病,给我国养猪业造成了极为惨重的经济损失。通过国内学者的不断的探索与研究,证实了该病的主要病原是高致病性PRRSV变异株。PRRSV属于动脉炎病毒科,尼多病毒目,为不分节段的单股正链RNA病毒；其基因组全长约为15 kb,含9个开放式阅读框（ORFs）,其中ORF1编码非结构蛋白,Nsp2基因长度约为2.9 kb,不同毒株因序列存在着差异而长度不一。在PRRSV的非结构蛋白中,Nsp2基因的保守性最差。但Nsp2含有多个B细胞表位,且表位集中的区域亲水性较强,具有较强的免疫原性,病毒感染后能够刺激机体产生特异性抗体（De Lima M et al.,2006; O leksiewicz MBetal.,2001）。本研究以猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV） Nsp2为研究对象,开展了对其免疫原性的研究。主要研究内容包括：1.猪繁殖与呼吸综合征病毒间接ELISA抗体检测方法的建立以PRRSV WUH3株为研究对象,对Nsp2基因进行分析,通过截去Nsp2基因C端跨膜区的疏水序列,采用RT-PCR方法获得了PRRSV的截短的Nsp2抗原决定区域,将其克隆到pET-28a（+）,构建原核重组表达质粒pET28a-Nsp2, IPTG诱导后蛋白获得了高效表达,Western-blot分析证明蛋白有免疫学活性,用得到的Nsp2蛋白以及N蛋白混合包被作为抗原,建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。2.猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp2单克隆抗体的制备取纯化的Nsp2蛋白按100μg/只的剂量与等量弗氏完全佐剂进行乳化,并作为免疫原采取常规皮下多点注射免疫6-8周龄BALB/c小鼠。取其脾细胞与SP2/0的骨髓瘤细胞融合,经间接酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选,采用有限稀释法进行克隆。经过3次克隆后获得了一株抗PRRSV Nsp2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为A2F1。Western-blot和间接免疫荧光结果显示这株单克隆抗体株能与Nsp2蛋白以及PRRSV WUH3株发生特异性反应,而不与PRRSV CH-1a株发生反应,证明获得的McAb为针对PRRSV WUH3株的McAb。抗体亚类鉴定结果表明,重链为IgG1型,轻链为K链。采用间接ELISA法测得单抗的细胞培养上清抗体效价为1：8000,腹水效价为1：128000。这株单抗的获得为进一步研究Nsp2基因的功能及建立准确快速PRRSV的诊断方法奠定了强有力的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第1章 文献综述
• 1.1 猪繁殖与呼吸综合征
• 1.1.1 PRRSV的分类
• 1.1.2 PRRSV的理化特性
• 1.1.3 PRRSV的抗原性
• 1.1.4 PRRSV的生物学特性
• 1.2 PRRSV分子生物学特征
• 1.2.1 PRRSV基因组的结构与功能
• 1.2.2 PRRSV的蛋白质
• 1.2.3 PRRSV的抗原性变异
• 1.2.4 PRRSV的毒力变异
• 1.3 PRRS的诊断研究
• 1.3.1 病毒分离
• 1.3.2 分子生物学检测方法
• 1.3.3 抗原检测
• 1.3.4 血清学试验检测抗体
• 第2章 研究目的和意义
• 第3章 材料与方法
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 毒株、细胞与菌株
• 3.1.3 载体与质粒
• 3.1.4 工具酶及主要试剂
• 3.1.5 主要缓冲液与相关试剂及其配制
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 RT-PCR扩增截去跨膜区序列的Nsp2基因片段
• 3.2.2 RT-PCR产物或酶切产物的电泳检测
• 3.2.3 PCR扩增产物或酶切产物回收与纯化
• 3.2.4 外源DNA片段与克隆质粒载体的连接反应
• 3.2.5 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
• 3.2.6 连接产物的转化
• 3.2.7 质粒的制备与鉴定
• 3.2.8 Nsp2的原核表达
• 3.2.9 表达产物的提取
• 3.2.10 表达产物的Western blot检测
• 3.2.11 重组蛋白间接ELISA方法的建立
• 3.2.12 猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp2单克隆抗体的制备
• 第4章 结果与分析
• 4.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒间接ELISA抗体检测方法的建立
• 4.1.1 截去跨膜区序列的Nsp2基因原核表达质粒的构建
• 4.1.2 截去跨膜区的Nsp2基因片段在大肠杆菌中的表达
• 4.1.3 Nsp2-ELISA、Nsp7-ELISA最佳抗原包被浓度与血清稀释度的确定
• 4.1.4 Nsp2-ELISA、Nsp7-ELISA阴阳临界值的确定
• 4.1.5 Nsp2-ELISA、Nsp7-ELISA、N-ELISA三种检测PRRSV抗体的ELISA方法的比较
• 4.1.6 Yhbw以及Nsp7-Yhbw基因原核表达质粒的构建
• 4.1.7 Yhbw以及Nsp7-Yhbw的原核表达
• 4.1.8 Yhbw-ELISA、Nsp7-Yhbw-ELISA最佳抗原包被浓度与血清稀释度的确定
• 4.1.9 Yhbw-ELISA、Nsp7-Yhbw-ELISA阴阳临界值的确定
• 4.1.10 Yhbw-ELISA、Nsp7-Yhbw-ELISA、Nsp7-ELISA三种检测PRRSV抗体的ELISA方法的比较
• 4.1.11 PRRSV ELISA方法的建立及应用
• 4.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NsP2单克隆抗体的制备
• 4.2.1 间接ELISA方法的建立
• 4.2.2 杂交瘤细胞株的建立
• 4.2.3 单抗的特异性鉴定
• 第5章 讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.1.1 截去跨膜区序列的Nsp2基因原核表达质粒的构建以及在大肠杆菌中的表达
• 5.1.2 pET-28a（+）-Nsp2融合蛋白的纯化
• 5.1.3 Yhbw以及Nsp7-Yhbw基因原核表达质粒的构建以及在大肠杆菌中的表达
• 5.1.4 pET-28b（+）-Yhbw以及pET-28a（+）-Nsp7-Yhbw融合蛋白的纯化
• 5.1.5 猪繁殖与呼吸综合征病毒间接ELLSA抗体检测方法的建立
• 5.1.6 猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp2单克隆抗体的制备
• 5.2 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录