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戊糖乳杆菌产γ-氨基丁酸及其乳制品的研究

2020-12-07阅读(998)

戊糖乳杆菌产γ-氨基丁酸及其乳制品的研究

论文摘要

γ-氨基丁酸（GABA）是一种非蛋白质组成的天然氨基酸,有很好的降低血压,镇静安神,抗焦虑,促进精子受精,改善肝肾功能等生理功能。GABA是由谷氨酸脱羧酶（GAD）催化L-谷氨酸（L-Glu）并脱羧合成而来。部分乳酸菌菌株具有转化L-谷氨酸生成GABA的能力。本文筛选获得了2株高产GABA的乳杆菌菌株（P和Ind-3）,基于细胞形态、菌株的生理生化特征以及16S rRNA测序数据证实这2株乳杆菌为戊糖乳杆菌,在此基础上,从产GABA戊糖乳杆菌代谢L-Glu生成GABA的条件、谷氨酸脱羧酶（GAD）的分离纯化和酶学性质以及产GABA菌株在发酵乳中的应用等方面进行研究,旨在利用高产GABA乳酸菌菌株来提高乳制品中的GABA含量,以此提高乳制品的功能性。主要结果如下:1、建立了γ-氨基丁酸（GABA）的液相色谱、改良纸层析法和Berthelot比色法三种检测方法的定性和定量分析程序。①液相色谱条件是:采用邻苯二甲醛为衍生试剂,色谱柱为反相C18柱（250mm×4.6mm,5μm）;流动相:0.1mol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH=6.0）∶四氢呋喃∶甲醇=52∶2∶46;检测条件:紫外338nm。②改良纸层析条件是:展开剂配方为:正丁醇:冰乙酸:水=4∶2∶1（含0.4g/L茚三酮）;30℃展开3.5h,风干后90℃烘干10min,将对应斑点剪下用洗脱液（V75%乙醇:V0.1%硫酸铜=38∶2）,洗脱25min后在510nm测定其吸光度值。③Berthelot比色法条件是:取0.6mL酶反应液加入0.4mL硼酸缓冲溶液中止反应,再加入0.8mL6%苯酚溶液和1.6mL次氯酸钠溶液（含有效氯5.25%）,沸水浴10min后迅速冰浴20min,在630nm测吸光度值。2、筛选得到两株具有较高产生GABA的乳杆菌菌株,基于细胞形态、生理生化特性和16s rRNA测试数据,2株乳杆菌被鉴定为戊糖乳杆菌,即Lactobacillus pentosusP和Lactobacillus pentosus Ind-3。在MRS培养基37℃厌氧培养48h,2株菌的GABA产量分别是0.3615g/L和0.1575 g/L。3、戊糖乳杆菌菌株P和Ind-3转化L-Glu合成GABA的优化条件是:最适发酵温度为37℃,pH 7.0,葡萄糖（20g/L）为碳源,胰蛋白胨、酵母膏及牛肉膏（均10g/L）为复合氮源,L-谷氨酸单钠（MSG）添加量15g/L,CaCl2浓度为0.5mmol/L,接种量2%（V/V,菌数108 cfu/mL）,种子的菌龄12h。在此优化条件下,当菌株P厌氧培养至72h时,GABA的产量为1.0020 g/L,而菌株Ind-3厌氧培养至84h,GABA的产量为0.3262g/L。将2株戊糖乳杆菌转至4℃贮存时,其改良MRS培养液中的GABA浓度继续上升,最高分别达到1.4064g/L和0.4563 g/L。4、戊糖乳杆菌菌株P和Ind-3的谷氨酸脱羧酶的相对分子质量为43 KD;酶的最佳反应时间是1 h;最佳反应温度为37℃。研究表明,戊糖乳杆菌的谷氨酸脱羧酶耐热性差,当温度超过60℃时,酶活力损失较快;酶的最适pH为4.8。研究了不同的金属离子（1mmol/L）对酶活的影响,其中Ca2+对谷氨酸脱羧酶活力有较大促进作用,菌株P和Ind-3的GAD酶活性分别提高了126%和223%,Cu2+、Mn2+和Mg2+对谷氨酸脱羧酶活力促进作用次之,菌株P的GAD酶活分别提高了63%,109%和47%;Ind-3的GAD酶活分别提高了60%,12%和50%。K+和Fe2+对谷氨酸脱羧酶活性起抑制作用,P的GAD酶活分别下降到59%和53%;Ind-3的GAD酶活分别下降到70%和63%。5、接种产GABA的戊糖乳杆菌菌株到脱脂乳中,37℃厌氧培养24h表明,外源添加MSG可以诱导发酵乳中的GABA生成;添加碳源对生成GABA的影响顺序是葡萄糖＞蔗糖＞乳糖,添加氮源对生成GABA的影响顺序是酵母膏＞蛋白胨＞牛肉膏;MSG的添加量为2 g/L。在上述条件下,与不添加MSG的发酵酸乳相比,接种戊糖乳杆菌菌株P和Ind-3的发酵乳中的GABA产量提高了3倍,分别达到0.2647g/L和0.0677g/L。发酵乳在4℃贮藏至21d时,接种2株戊糖乳杆菌发酵乳中的GABA含量呈上升趋势,分别提高了35%和45%。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 引言
  • 1.1 γ-氨基丁酸的发现
  • 1.2 γ-氨基丁酸的生理功能及作用机制
  • 1.2.1 降低血压
  • 1.2.2 改善脑机能
  • 1.2.3 对生理生殖的影响
  • 1.2.4 对呼吸系统的作用
  • 1.2.5 其它的功能
  • 1.3 γ-氨基丁酸的合成及强化
  • 1.3.1 γ-氨基丁酸的来源
  • 1.3.2 微生物中γ-氨基丁酸的代谢
  • 1.4 γ-氨基丁酸检测技术
  • 1.4.1 改良纸层析法
  • 1.4.2 比色法
  • 1.4.3 高效液相色谱法
  • 1.4.4 氨基酸分析仪
  • 1.4.5 高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法
  • 1.4.6 蒸发光散射检测技术
  • 1.4.7 放射受体法
  • 1.4.8 气相色谱质谱联用法
  • 1.5 GABA产品的应用现状
  • 1.6 本研究的目标
  • 2 材料与方法
  • 2.1 试验菌株
  • 2.2 培养基及培养条件
  • 2.2.1 MRS培养基
  • 2.2.2 12%的复原脱脂乳
  • 2.2.3 培养条件
  • 2.2.4 菌种保存
  • 2.3 主要试剂及仪器设备
  • 2.3.1 重要试剂及材料
  • 2.3.2 仪器设备
  • 2.4 研究方法
  • 2.4.1 GABA的分析检测方法的确立
  • 2.4.2 产GABA的乳酸菌株的筛选
  • 2.4.3 乳酸菌株鉴定
  • 2.4.4 戊糖乳杆菌代谢L-Glu生成GABA发酵条件的优化
  • 2.4.5 戊糖乳杆菌转化L-Glu生成GABA动力学研究
  • 2.4.6 谷氨酸脱羧酶的分离纯化及酶学性质的研究
  • 2.4.7 发酵乳制品中GABA含量的研究
  • 3 结果与分析
  • 3.1 GABA的分析检测方法的确立
  • 3.1.1 GABA标准品液相色谱的测定
  • 3.1.2 GABA标准品改良纸层析法的测定
  • 3.1.3 GABA标准品Berthelot比色法的测定
  • 3.2 高产GABA菌株的筛选
  • 3.2.1 菌株初筛
  • 3.2.2 菌体生长曲线的测定
  • 3.3 菌株鉴定
  • 3.3.1 乳杆菌菌落形态
  • 3.3.2 乳杆菌生理生化鉴定结果
  • 3.3.3 分子生物学方法鉴定———16S rRNA扩增及序列测定
  • 3.4 戊糖乳杆菌发酵条件的优化
  • 3.4.1 培养温度对菌体生物量及GABA产量的影响
  • 3.4.2 初始pH值对菌体生物量及GABA产量的影响
  • 3.4.3 不同碳源对菌体生物量及GABA产量的影响
  • 3.4.4 不同氮源对菌体生物量及GABA产量的影响
  • 3.4.5 不同复合碳源对菌体生物量及GABA产量的影响
  • 3.4.6 不同碳氮比对菌体生物量及GABA产量的影响
  • 3.5 戊糖乳杆菌代谢L-Glu转化生成GABA动力学研究
  • 3.5.1 底物的添加量对菌体的生物量及GABA产量的影响
  • 3.5.2 PLP和钙离子对菌体的生物量及GABA产量的影响
  • 3.5.3 种子培养液的菌龄对菌体的生物量及GABA产量的影响
  • 3.5.4 接种量对菌体的生物量及GABA产量的影响
  • 3.5.5 发酵过程中菌体代谢L-Glu生成GABA最佳时间的确立
  • 3.5.6 贮存期发酵液中的GABA的变化
  • 3.5.7 优化发酵条件后发酵液中的GABA的液相色谱检测
  • 3.6 谷氨酸脱羧酶的分离纯化及酶学性质的研究
  • 3.6.1 蛋白含量测定
  • 3.6.2 硫酸铵分级沉淀
  • 3.6.3 谷氨酸脱羧酶纯化及酶分子量的确定
  • 3.6.4 谷氨酸脱羧酶反应体系当中GABA的液相色谱检测
  • 3.6.5 谷氨酸脱羧酶酶学性质研究
  • 3.7 发酵乳制品中菌体代谢L-Glu生成GABA的研究
  • 3.7.1 添加MSG对发酵牛乳GABA生成的影响
  • 3.7.2 乳中添加不同的碳源对菌体生长及GABA产量的影响
  • 3.7.3 乳中添加不同的氮源对菌体生长及GABA产量的影响
  • 3.7.4 发酵乳制品在贮存期间GABA含量的变化
  • 4 讨论
  • 4.1 液相色谱用于GABA的分析检测
  • 4.2 改良纸层析法用于GABA的分析检测
  • 4.3 不同因素对戊糖乳杆菌代谢L-Glu生成GABA产量的影响
  • 4.3.1 发酵温度
  • 4.3.2 初始pH值
  • 4.3.3 碳源的变化
  • 4.3.4 氮源的变化
  • 4.3.5 碳氮比的变化
  • 4.3.6 MSG添加量
  • 4.3.7 种子菌龄和菌体浓度
  • 4.3.8 PLP和钙离子
  • 4.3.9 发酵时间及贮存时间
  • 4.3.10 MRS培养基中戊糖乳杆菌生成GABA的液相色谱检测
  • 4.4 谷氨酸脱羧酶的分离纯化及酶学性质的研究
  • 4.4.1 谷氨酸脱羧酶的微生物来源
  • 4.4.2 谷氨酸脱羧酶纯化及酶的分子量
  • 4.4.3 谷氨酸脱羧酶酶学性质
  • 4.5 发酵脱脂乳制品中GABA含量的研究
  • 4.5.1 添加MSG
  • 4.5.2 添加碳源和氮源
  • 4.5.3 贮藏期间GABA变化
  • 4.6 展望
  • 5 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 在读期间发表的学术论文
  • 作者简历
  • 致谢

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