轮状病毒VP4、VP7抗原在烟草中的表达

论文摘要

轮状病毒（Rotavirus,RV）是世界范围内引起婴幼儿和各种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原体,RV感染在社会中引起严重的经济损失。迄今,对RV感染除了对症处理外并无特效药物,因此研究和开发安全有效的轮状病毒疫苗具有很重要的意义。研究表明,将细菌性和病毒性病原体抗原的编码基因导入植物细胞,能够表达出较好保留天然免疫原性的抗原,这为利用转基因植物生产疫苗提供了可靠的依据。VP4和VP7是轮状病毒的主要外壳蛋白和中和抗原,因此,将VP4和VP7基因在植物中表达,获得具有免疫原性的轮状病毒植物口服疫苗,具有潜在的社会意义和经济价值。 本研究以VP4和VP7为目的基因,设计具有BamH Ⅰ和Sac Ⅰ酶切位点及Kozak序列的VP4基因引物,采用套叠PCR对VP4进行定点突变,构建了pBI121-VP4植物表达载体;同时设计具有BamH Ⅰ和Sal 1酶切位点及Kozak序列的VP7基因引物,构建了pBin438-VP7植物表达载体。利用农杆菌介导法,转化烟草叶盘,经卡那霉素（Kan）多重筛选,获得抗性植株。对抗性植株提取DNA进行PCR分析,40-50%抗性植株呈阳性。选取几株生长良好的PCR检测为阳性的转基因烟草植株提取总DNA经HindⅢ内切酶消化后进行Southen-blot分析,结果表明所有待检样品均出现较强的特异杂交信号,对Southern-blot检测为阳性的植株,提取总蛋白进行Western-blot分析,证明部分植株表达了轮状病毒VP4和VP7。 本研究为研究和开发新型轮状病毒口服疫苗提供一条新的途径和方法,具有一定的理论意义和应用前景。

论文目录

• 前言
• 第一章 转基因植物生产轮状病毒疫苗研究进展
• 第二章 实验研究
• 实验一 VP4植物表达载体的构建
• 1 实验材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 模板的制备
• 2.2 引物设计与合成
• 2.3 PCR反应及PCR产物的回收
• 2.4 扩增产物的克隆及转化
• 2.5 pT-VP4Ⅱ重组质粒的鉴定
• 2.6 线性化pBI121载体的制备
• 2.7 线性化载体与VP4基因片段的连接
• 2.8 pBI-VP4重组质粒的鉴定
• 2.9 pBI-VP4重组质粒转化农杆菌感受态
• 3 结果与分析
• 3.1 pT-VP4Ⅰ PCR扩增结果
• 3.2 重组质粒pT-VP4Ⅱ鉴定结果
• 3.3 重组质粒pBI-VP4鉴定结果
• 3.4 pBI-VP4／EHA105鉴定结果
• 实验二 VP7植物表达载体的构建
• 1 实验材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 主要试剂及仪器设备
• 2 方法
• 2.1 模板的制备
• 2.2 引物设计与合成
• 2.3 PCR反应及PCR产物的回收
• 2.4 扩增产物的克隆
• 2.5 pT-VP4Ⅱ重组质粒的鉴定
• 2.6 线性化pBI121载体的制备
• 2.7 线性化载体与VP4基因片段的连接
• 2.8 pBI-VP4重组质粒的鉴定
• 2.9 pBI-VP4重组质粒转化农杆菌感受态
• 3 结果与分析
• 3.1 pT-VP4Ⅰ PCR扩增结果
• 3.2 重组质粒pT-VP4Ⅱ鉴定结果
• 3.3 重组质粒pBI-VP4鉴定结果
• 3.4 pBI-VP4／EHA105菌落PCR鉴定结果
• 实验三 VP4、VP7在烟草中的表达及转基因烟草的检测
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 烟草再生体系的建立及抗生素敏感性试验
• 2.2 pBI-VP4／EHA105、pB-VP7／EHA105转化烟草（农杆菌介导法）
• 2.3 转基因烟草的分子检测
• 3 结果与分析
• 3.1 烟草转化、筛选、移栽结果
• 3.2 转基因烟草PCR检测结果
• 3.3 转基因烟草Southern-blot检测结果
• 3.4 转基因烟草Western-blot检测结果
• 第三章 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历
• 导师评语