细胞浆PrP在SH-SY5Y细胞中的表达及其对细胞凋亡的影响

论文摘要

蛋白的异常折叠或错误构象可引起动物和人类的神经退行性疾病,如动物的疯牛病（BSE）、羊的瘙痒症（scrapie）;人类的阿尔茨海默症、朊病毒病等。通过我们的实验发现朊蛋白的异常构型会产生细胞毒性,特别是由内质网（ER）逆转入胞浆中的朊蛋白（CytoPrP）及滞留在胞浆中的未经正常生理途径的异常折叠的PrP作用更为显著,被证明具有神经毒性并且诱导神经元的迅速死亡。为探讨CytoPrP的聚集引起的神经毒性的机制,我们构建缺失PrP蛋白N端信号肽和C端信号肽（GPI）的质粒,并导入人的神经母细胞瘤细胞系（SH-SY5Y）中。MTT检测和Trypan Blue检测显示转染表达胞浆PrP（CytoPrP）组在培养液中加入蛋白酶抑制剂MG-132时,在SH-SY5Y中的表达与转染野生型PrP（PrP1-253）表达质粒组相比细胞的存活率明显降低（P＜0.01）,而在细胞浆中表达的绿色荧光蛋白GFP则无此影响。还发现,CytoPrP的细胞毒性作用受蛋白酶抑制剂含量的影响。蛋白酶敏感性实验显示,CytoPrP相对于PrP1-253具有一定的蛋白酶K（PK）抗性,CytoPrP可抵抗8μg/mL PK的消化,PrP1-253只可部分抵抗4μg/mL PK的消化。显著的细胞凋亡现象在CytoPrP表达的细胞中可被检测到,包括线粒体膜电位（ψm）的降低、caspase-3活性的增加、annexin V/PI双染阳性细胞的增多及Bcl-2蛋白水平的降低的等。并且,过氧化氢酶（catalase）的水平在CytoPrP表达细胞中有显著的增加。除此之外,DNA片段梯子实验和TUNEL检测也揭示了CytoPrP表达细胞中明显的晚期凋亡迹象。这些数据提示CytoPrP在胞浆中的聚集,可能启动细胞凋亡,而线粒体相关的凋亡途径可能起着至关重要的作用。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 朊蛋白简介
• 1.2 PrP在胞内能够提高细胞活性
• 1.2.1 PRNP基因敲除（Prnp-/-）小鼠的海马神经细胞更易受凋亡和氧化应激因素的影响
• 1.2.2 PrP的异常表达保护人的原代神经细胞免受Bax介导的细胞凋亡
• 1.2.3 内源表达的PrP可抑制细胞凋亡
• 1.2.4 PrP的神经保护性机制——阻止线粒体早期凋亡途径
• 1.3 PrP在体外可以提高细胞活力
• 1.3.1 PrP可以保护大脑免受Depple蛋白介导的细胞死亡的影响
• 1.3.2 PrP阻止N端截短的PrP（PrPΔ32-134）介导的神经退化
• 1.3.3 PrP59-91使细胞免受铜离子介导的神经毒性作用
• 1.4 关于PrP的神经保护性功能的争议
• 1.5 PrP在朊蛋白疾病中的神保护性功能
• 1.6 小结
• 第二章 实验研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 细胞系
• 2.1.4 工具酶和分子量标准
• 2.1.5 试剂盒和其它主要化学试剂
• 2.1.6 细菌和细胞培养基
• 2.1.7 主要仪器和设备
• 2.1.8 常用的溶液、缓冲液
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 去除N端和C端信号肽的胞浆PrP的PRNP基因及GFP基因的获得
• 2.2.2 PCR及酶切产物的回收
• 2.2.3 克隆载体的构建
• 2.2.4 重组体的筛选和鉴定
• 2.2.5 真核表达载体的构建
• 2.2.6 pcDNA3.1（zero+）空载体及pcONA3.1-huCytoPrP、pcDNA3.1-GFP、pcDNA3.1-huPrP1-253真核表达载体质粒的大量提取纯化
• 2.2.7 细胞的复苏
• 2.2.8 细胞的传代
• 2.2.9 脂质体介导SH-SYSY细胞的瞬时转染
• 2.2.10 间接免疫荧光鉴定转染后重组PrP蛋白的表达情况
• 2.2.11 Western blot检测转染后重组PrP蛋白的表达情况
• 2.2.12 MTT方法分析胞浆表达CytoPrP对细胞生长的影响
• 2.2.13 Trypan blue法检测细胞死亡百分比
• 2.2.14 JC-1染色分析线粒体膜电位ψm的变化
• 2.2.15 Annexin V/PI双染检测细胞早期凋亡
• 2.2.16 DNA末端原位标记染色法（TUNEL）
• 2.2.17 DNA Ladder检测
• 2.2.18 caspase-3活性的检测
• 2.2.19 表达CytoPrP的SH-SY5Y细胞中凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的检测
• 2.2.20 谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性检测
• 2.2.21 过氧化氢酶（catalase）活性的检测
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 胞浆中CytoPrP真核表达质粒的构建
• 2.3.2 PrP1-253及CytoPrP在细胞内的不同表达形式
• 2.3.3 胞浆CytoPrP蛋白具有较强的PK抗性
• 2.3.4 CytoPrP的存在可诱导显著的细胞毒性效应
• 2.3.5 CytoPrP对SH-SY5Y细胞形变化变的影响
• 2.3.6 CytoPrP的细胞毒性作用受蛋白酶抑制剂含量的影响
• 2.3.7 CytoPrP诱导SH-SY5Y细胞的早期凋亡
• a CytoPrP对线粒体膜电位ψm的影响
• b Caspase家族成员参与CytoPrP蛋白诱导的细胞凋亡
• 2.3.8 CytoPrP诱导SH-SY5Y细胞的晚期凋亡
• a Annexin-V/PI双染检测细胞凋亡
• b CytoPrP表达对SH-SY5Y细胞染色质DNA的影响
• c 原位标记染色法检测的细胞凋亡（TUNEL）
• 2.3.9 Bcl-2水平在CytoPrP表达的细胞中降低
• 2.3.10 表达CytoPrP的SH-SY5Y细胞过氧化氢酶水平降低,谷胱甘肽还原酶不变
• 2.4 讨论
• 第三章 结论
• 参考文献
• 附录
• 附录1.SCI文章（第一作者,附摘要）
• 附录2.英文缩略词及英、汉对照
• 附录3.胞浆CytoPrP aa23-230基因序列测序结果
• 附录4.硕士期间的其它研究成果
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的SCI及中文期刊论文