几种分子标记技术的建立及其在部分柿属植物亲缘关系研究中的应用

论文摘要

柿是柿科（Ebenaceae）柿属（Diospyros Linn. ）植物，我国是柿属植物的分布中心和原产中心之一，捌有丰富的种质资源。但长期以来，对我国柿属植物的种类和分布还缺乏清楚的了解，对我国柿属植物的起源、演化和亲缘关系缺乏深入的探讨。本研究首次开发了柿属植物SSR分子标记技术，并同时采用SSR，SRAP，IRAP和REMAP四种DNA分子标记技术，分别对供试7种柿属植物（柿Diospyros kaki Thunb. ；君迁子D. Lotus L. ；浙江柿D. glaucifolia Metc. ；油柿D. oleifera Cheng. ；金枣柿；老鸦柿D. rhombifolia Herosl. ；美洲柿D. virginian L. ；）进行了亲缘关系分析，以期从DNA水平上明确柿种间及种下的亲缘关系和分类地位，为柿属植物种质资源的科学利用提供依据。主要结果如下： 1．利用数据库查询的方法开发柿属植物SSR引物。查询GenBank，EMBL和DDBJ数据库中的柿属植物核酸序列，采用Sputnik筛选包含SSR的序列，用Primer Primere 5.0设计SSR引物。从98条核酸序列中共计筛选到SSR引物7对，并建立起柿属植物SSR-PCR扩增技术体系。 2．利用ISSR技术结合抑制PCR技术开发SSR引物。使用ISSR引物8条，对基因组DNA扩增后，设计抑制PCR引物进行染色体步行，共计开发出12对SSR引物，其中9对表现较好。在GenBank上登录序列19条。 3．采用链亲和素（streptavidin）与生物素（biotin）之间具有很强的亲和能力的原理，用链亲和素磁珠富集法使用生物素标记的探针（GA）10开发柿SSR引物6对，并在GenBank上登录6条。 4．利用自主开发的SSR标记，选用18对SSR引物对柿属植物的亲缘关系进行分析，实验中采用两种电泳方式进行检测。有关等位基因的相关信息从PAGE胶上获得，聚类图构建的数据则来源于琼脂糖凝胶电泳。结果通过琼脂糖凝胶电泳检测方式共得到158条多态性带，每个引物检测的带数从5到20条不等。6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上检测到的等位位点数的变化从3到24不等，平均每个引物检测到15个位点。PAGE胶上所检测的扩增条带数明显比琼脂糖凝胶上的多。根据琼脂糖凝胶所获得的数据由NTSYS计算30份试材间的相似系数，结果表明供试材料的相似系数变化范围在0.42（浙江柿和老鸦柿）到0.93（富有和松本早生）间，平均值0.79。日本柿，中国柿和近缘种间相似系数平均值分别为0.83，0.81和0.71。期望杂合度和表观杂合度变化范围分别为0.42-0.77和0.27-0.59。 5．利用SRAP标记，使用文献中运用较多的7条正向引物，8条反向引物，通

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 课题的提出和前人研究进展
• 1.1 课题的提出
• 1.2 前人研究进展
• 1.2.1 柿属植物种质资源研究进展
• 1.2.1.1 柿属植物的种类和分布
• 1.2.1.2 柿的原产地和起源植物
• 1.2.1.3 柿品种鉴定和亲缘关系
• 1.2.2 种质资源研究中的分子标记概述
• 1.2.3 SSR分子标记技术
• 1.2.3.1 SSR引物开发途径
• 1.2.3.1.1 数据库查询
• 1.2.3.1.2 引物的转移扩增
• 1.2.3.1.3 建立基因组文库
• 1.2.3.1.4 与分子标记技术结合开发SSR引物
• 1.2.3.1.4.1 利用RAPD方法筛选SSR
• 1.2.3.1.4.2 利用AFLP方法筛选SSR
• 1.2.3.1.4.3 利用ISSR方法筛选SSR
• 1.2.3.1.4.4 其他方法
• 1.2.3.1.4.5 不同SSR引物分离方法评述
• 1.2.3.2 SSR标记在果树中的应用
• 1.2.3.2.1 构建遗传图谱
• 1.2.3.2.2 种质鉴定及系谱分析
• 1.2.3.2.3 遗传多样性分析
• 1.2.3.2.4 基因的标定与标记辅助育种
• 1.2.4 SRAP分子标记技术
• 1.2.4.1 引物特征
• 1.2.4.2 PCR扩增程序
• 1.2.4.3 SRAP技术的应用
• 1.2.4.3.1 种质鉴定和遗传多样性分析
• 1.2.4.3.2 亲缘关系分析
• 1.2.4.3.3 构建遗传连锁图
• 1.2.4.3.4 基因连锁标记的寻找与基因定位
• 1.2.3.4.5 比较基因组学研究
• 1.2.4.4 SRAP技术和其它分子标记技术的比较
• 1.2.5 基于反转录转座子的分子标记
• 1.2.5.1 植物反转录转座子的类型
• 1.2.5.2 反转录转座子分子标记的种类
• 1.2.5.2.1 序列特异扩增多态性
• 1.2.5.2.2 反转录转座子间扩增多态性
• 1.2.5.2.3 反转录转座子—微卫星扩增多态性
• 1.2.5.2.4 基于反转录转座子插入多态性
• 1.2.5.3 反转录转座子分子标记的多态性
• 1.2.5.4 基于反转录转座子的分子标记的应用
• 1.2.5.4.1 遗传作图和重要农艺性状基因的标记
• 1.2.5.4.2 生物多样性与系统进化研究
• 1.2.5.4.3 种质鉴定
• 1.3 研究目的和研究内容
• 1.3.1 研究目的
• 1.3.2 研究内容
• 第二章 柿属植物SSR分析技术的建立
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 DNA提取
• 2.1.3 数据库查寻和引物设计
• 2.1.4 SSR反应参数的优化
• 2.1.5 SSR产物的检测
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 数据库搜寻和引物设计
• 2.2.2 SSR技术体系的优化
• 2+浓度'>2.2.2.1 Mg²⁺浓度
• 2.2.2.2 dNTPs浓度
• 2.2.2.3 引物浓度
• 2.2.2.4 Taq酶浓度
• 2.2.2.5 退火温度
• 2.2.2.6 引物
• 2.2.2.7 SSR反应体系的确立
• 2.3 讨论
• 2.3.1 SSR发掘程序和引物设计
• 2.3.2 SSR技术体系的建立
• 2.3.3 数据库查询方法的有效性
• 第三章 柿属植物SSR引物的分离
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 柿基因组DNA提取
• 3.1.3 柿SSR标记的分离
• 3.1.3.1 基于ISSR技术分离柿SSR
• 3.1.3.1.1 ISSR扩增
• 3.1.3.1.2 ISSR产物克隆测序
• 3.1.3.1.2.1 ISSR—PCR产物纯化
• 3.1.3.1.2.2 ISSR—PCR产物克隆
• 3.1.3.1.2.3 感受态细胞制备
• 3.1.3.1.2.4 转化
• 3.1.3.1.2.5 质粒DNA的提取
• 3.1.3.1.2.6 阳性克隆检测
• 3.1.3.1.2.7 测序与序列分析
• 3.1.3.1.3 染色体步行
• 3.1.3.1.3.1 基因组DNA的酶切
• 3.1.3.1.3.2 接头的准备
• 3.1.3.1.3.3 接头连接
• 3.1.3.1.3.4 抑制PCR第一轮扩增
• 3.1.3.1.3.5 抑制PCR第二轮扩增
• 3.1.3.1.3.6 产物克隆测序和引物设计
• 3.1.3.2 磁珠富集法分离柿SSR
• 3.1.3.2.1 基因组DNA酶切
• 3.1.3.2.2 接头的准备
• 3.1.3.2.3 接头的连接
• 3.1.3.2.4 目的片段扩增
• 3.1.3.2.5 杂交
• 3.1.3.2.6 富集
• 3.1.3.2.7 克隆、测序和引物设计
• 3.2 结果和分析
• 3.2.1 ISSR结合抑制PCR技术富集SSR
• 3.2.1.1 ISSR扩增和测序结果
• 3.2.1.2 抑制PCR和SSR序列的获得
• 3.2.2 磁珠富集法分离SSR
• 3.3 讨论
• 3.3.1 ISSR结合抑制PCR技术分离SSR标记方法的探讨
• 3.3.2 磁珠富集法分离SSR标记方法的探讨
• 3.3.3 引物的有用性
• 第四章 部分柿属植物亲缘关系的SSR分析
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 DNA提取
• 4.1.3 SSR扩增
• 4.1.4 SSR产物的检测
• 4.1.4.1 琼脂糖凝胶电泳
• 4.1.4.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染程序
• 4.1.4.2.1 玻璃板的准备
• 4.1.4.2.2 制胶
• 4.1.4.2.3 预电泳
• 4.1.4.2.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 4.1.4.2.5 银染
• 4.1.4.2.6 数据分析
• 4.2 结果和分析
• 4.2.1 SSR标记的多态性
• 4.2.2 基于SSR标记的聚类分析
• 4.3 讨论
• 4.3.1 SSR分析电泳方式
• 4.3.2 部分柿属植物种质间SSR聚类结果
• 第五章 部分柿属植物亲缘关系的SRAP分析
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 DNA提取与分离
• 5.1.3 SRAP反应体系优化
• 5.1.3.1 PCR扩增程序选择
• 5.1.3.2 SRAP扩增所选用引物序列
• 5.1.3.3 SRAP反应参数的优化
• 5.1.3.4 SRAP产物的检测
• 5.1.3.5 数据分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 柿属植物SRAP反应体系的建立
• 2+浓度'>5.2.1.1 Mg²⁺浓度
• 5.2.1.2 dNTPs浓度
• 5.2.1.3 引物浓度
• 5.2.1.4 Taq酶浓度
• 5.2.1.5 SRAP反应体系的确立
• 5.2.2 SRAP多态性分析
• 5.2.3 29个样品的聚类分析
• 5.2.4 主坐标分析
• 5.3 讨论
• 5.3.1 SRAP反应体系的优化
• 5.3.2 基于SRAP标记的聚类分析
• 5.3.3 SRAP标记及多态性
• 第六章 部分柿属植物亲缘关系的IRAP和REMAP分析
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 DNA提取
• 6.1.3 引物设计
• 6.1.4 PCR扩增及产物检测
• 6.1.5 数据统计和聚类分析
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 IRAP和REMAP标记多态性
• 6.2.2 相似系数和聚类分析
• 6.3 讨论
• 6.3.1 IRAP和REMAP分子标记技术在柿属植物中的应用
• 6.3.2 部分柿属植物种质IRAP和REMAP聚类结果
• 第七章 总讨论
• 7.1 柿属植物SSR引物开发
• 7.2 部分柿属植物不同分子标记方法聚类分析结果
• 7.3 不同聚类方法的比较
• 7.4 金枣柿的分类地位
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间发表论文
• 致谢