论文摘要
鼠疫是人类历史上最古老、最严重的烈性传染病之一,由于鼠疫的爆发流行往往给人类造成重大伤亡,所以对鼠疫耶尔森氏菌（以下简称鼠疫菌）的检测和防治一直被鼠疫学界和医学界所重视。对于鼠疫菌的检测方法主要有,传统的“四步检验法”、基于血清学和核酸的各种方法;以Taqman探针为基础的荧光定量PCR方法属于基于核酸的检测方法之一。目的:尽管基于Taqman探针的荧光定量PCR技术已经被用于检测和鉴定鼠疫菌多年,关于定量PCR试剂在室温条件下的稳定性研究却少见于报道,而在实际应用中无论是鼠疫流病调查、突发公共卫生事件应急和反生物恐怖等,室温条件下稳定的PCR检测试剂都是必不可少的。本研究中根据上述现实需求,先建立用于鼠疫菌检测的荧光定量PCR体系,并在此基础之上摸索出使试剂在室温保持稳定的方法,为实际应用中的需求和将来荧光定量PCR试剂的产品化应用奠定基础。方法:分别根据鼠疫菌染色体上的3a片段和质粒pMT1上编码F1蛋白的基因caf1设计引物和探针序列,建立荧光定量PCR的反应体系,优化了引物和探针的浓度、反应体系中镁离子的浓度以及反应的程序的各参数。在验证反应体系的特异性实验里,我们选取的基因组核酸包括:耶尔森氏菌属的9个种、鼠疫菌的4中生物型（古典型、中世纪型、东方型和田鼠型）、与鼠疫菌非常近缘的假结核耶尔森氏菌16种血清型,以及常见的土拉弗朗西斯氏菌、炭疽芽孢杆菌、布鲁氏菌和大肠杆菌DH5α,另外还包括人血液核酸和小鼠基因组。灵敏度实验中,以鼠疫菌的疫苗株EV76的系列稀释菌液作为检测的样本,以涂板计数法确定菌液浓度。试剂的稳定性实验研究,参考国内外的相关研究和我实验室的技术积累,我们将反应体系混合后加入糖类物质作为稳定剂;又因为酶和引物在干燥的条件下保持更久的性质,我们将混合好试剂按一个反应体系的剂量分装到各个小管中,然后对试剂真空抽干;在评估经过上述处理的试剂的稳定性实验中,我们将抽干试剂避光分别保存于-20℃和37℃,通过高温加速对试剂的破坏作用,取合适时间点对两种条件下保存的试剂使用同一浓度的模板反应,检验试剂在高温的条件下保持稳定的情况。模拟污染土壤样本实验,我们用EV76菌液污染土壤制备模拟的土壤样本,摸索了一套从土壤样本中提取核酸、并可成功进行荧光定量PCR的处理流程;还进行了特异性实验、灵敏度实验和盲测实验。最后我们将自制的产品化试剂与国外同类的鼠疫菌检测试剂进行了对比实验,验证在现场的条件下对于水体样本和纯菌液样本的检测效果,为将来使用自制试剂替代进口试剂提供了参考。结果:优化了荧光定量PCR检测体系内相关试剂的浓度和反应的程序参数,在验证反应体系的特异性实验里,我们设计的引物和探针只对鼠疫菌的四种生物型有阳性结果,而相关的近缘菌株和非近缘但是常见的菌株都无阳性反应,显示了引物和探针较好的特异性。体系的灵敏度实验中,3a的引物和探针对活菌稀释液的检测灵敏度为1.5 CFU每反应体系,而caf1的引物和探针的灵敏度为15 CFU每反应体系。试剂的稳定性实验结果:试剂加入稳定剂并抽干后,在37℃、避光保存的条件下,在至少49天的时间内对低浓度的模板（101拷贝/μl）依然可保证检测灵敏度,而对高浓度的模板（大于102拷贝/μl）在79天里依然保证灵敏度。进一步的工作中,我们应用上述试剂对使用鼠疫菌疫苗株EV76污染的模拟土壤样本进行了实验,3a和caf1引物和探针仍然保持了很好的特异性,可检测的灵敏度均为5×104 CFU/克土壤;同时我们也摸索了一套简捷、有效的样本处理方法。结论:PCR反应体系在室温条件下的稳定性研究在1995年出现,可是随后相关方面的研究工作却很少,而对于荧光定量PCR检测体系而言,尚未见到国内外相关的文献报道,开展这方面的研究无论是对于普通PCR和荧光定量PCR在现场条件下的应用和日常的试剂运输等方面,还是为将来我们的试剂可以本土化以取代昂贵的进口试剂方面都具有现实意义。实验中,真空抽干后的荧光定量PCR检测试剂在37℃至少可保存49天而保持其检测准确性和重复性,提示在实际应用中试剂可以在室温运输和保存,为定量PCR检测试剂今后的应用提供了一定参考。