真核翻译起始因子5A与月季耐热遗传机制研究

论文摘要

eIF-5A（Eukaryotic translation initiation factor 5A,真核翻译起始因子5A）是目前发现的唯一含有特殊氨基酸—羧腐胺赖氨酸残基（hypusine）的蛋白质。hypusine（Nε-4-氨基-2-脱氧丁基-赖氨酸）是由两个酶在翻译后修饰形成的:DHS（deoxyhypusine synthase,脱氧hypusine合酶）和DOHH（脱氧hypusine羟化酶）。Hypusine形成中的第一个反应是由DHS催化的,将丁胺加在eIF-5A保守的赖氨酸上,形成脱氧hypusine。第二步反应是脱氧hypusine羟化酶把脱氧hypusine转变成hypusine。Hypusine的修饰在eIF-5A翻译后就立即开始,如果对细胞进行脱氧hypusine合酶或者脱氧hypusine羟化酶抑制剂处理,eIF-5A的前体（赖氨酸形式）或者eIF-5A的中间体（脱氧hypusine形式）就会积累。在很多植物中已经分离出编码DHS和eIF-5A的全长cDNA。重组的植物DHS能够催化非活性的eIF-5A脱氧hypusine的形成,重组的eIF-5A植物eIF-5A基因能够被脱氧hypusine修饰。植物hypusine是高度保守的（在氨基酸水平上有80-90%的一致性）,但与人、酵母、和真菌的eIF-5A仅仅有50-60%的一致性。本论文以月季为研究材料。月季,别名:长春花、月月红、四季花。顾名思义,她以连续的花期、多彩的花色、芳香的气息以及对温度的不敏感等特性成为城市绿化的主角。目前,在花卉上关于高温抑制开花的研究在我国仍是空白,如果通过本课题的研究能在月季上有所突破,研究耐热月季所具有的生理与遗传的适应机制,将为培育出能在高温下正常开花的其他花卉优良品种提供一定的理论基础。本研究通过RT-PCR方法获得了月季中编码eIF-5A基因的cDNA,在大肠杆菌中过表达验证其功能。同时,通过反义技术,将RceIF-5A转入在酵母中抑制内源eIF-5A的表达,从而验证其功能。而且还研究了月季中eIF-5A的拷贝数和在不同器官中的表达情况,从而提出在月季中存在不同的eIF-5A来调控衰老与发育。本论文获得如下研究结果:1.通过RT-PCR方法获得了热处理后月季叶片的编码eIF-5A的cDNA。通过Southern blot分析目的基因在月季基因组中存在的拷贝数,发现eIF-5A在月季基因组中以低拷贝形式存在。2.通过RT-PCR方法,研究eIF-5A基因在月季不同器官中的表达特性,在新叶和老叶中目的基因高表达。3.将RceIF-5A的cDNA片段构建入原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达。结果显示:大肠杆菌的转基因菌株与对照相比对高温和低温有明显的耐性。4.将RceIF-5A的cDNA片段通过反义技术转入真核表达载体,在酵母中诱导表达。结果发现转基因的株系与对照相比对高温有更好的耐性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 选用月季为研究材料的目的与意义
• 1.2 EIF-5A基因的研究进展
• 1.2.1 eIF-5A在翻译后修饰起作用
• 1.2.2 eIF-5A翻译够修饰过程中的两个酶
• 1.2.3 eIF-5A不是一个传统意义上的翻译起始因子
• 1.2.4 eIF-5A的功能研究
• 1.2.5 抑制植物eIF-5A的活性产生多向性作用
• 1.2.6 抑制植物eIF-5A表达产生的多重效应可用于植物经济性状的改良
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 细菌载体和主要试剂
• 2.1.3 主要的仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 月季eIF-5A基因cDNA的克隆
• 2.2.2 月季基因组DNA提取与Southern blot分析
• 2.2.3 RT-PCR
• 2.2.4 RceIF-5A的原核表达及抗His抗体的Western blot检测
• 2.2.5 RceIF-5A的大肠杆菌实验
• 2.2.6 AntiRceIF-5A的酵母实验
• 3 结果与分析
• 3.1 月季EIF-5A基因的克隆和序列分析
• 3.2 RCEIF-5A基因和其他物种EIF-5A基因的系统进化分析
• 3.3 SOUTHERN杂交分析
• 3.4 RT-PCR检测RCEIF-5A基因的表达模式
• 3.5 含有月季EIF5A编码基因的原核表达载体的构建与鉴定
• 3.6 RC EIF-5A在E. COLI中的诱导表达
• 3.7 重组菌BL21 （PET32A-EIF5A）对温度胁迫的抗性分析
• 3.7.1 重组菌BL21 （pET32a-eIF5A）在正常条件下的生长实验
• 3.7.2 重组菌BL21 （pET32a-eIF5A）在高温条件下的生长实验
• 3.7.3 重组菌BL21 （pET32a-eIF5A）在低温条件下的生长实验
• 3.8 ANTI-EIF-5A基因的真核表达载体构建与鉴定
• 3.9含有空载体和重组质粒PET32A-EIF-5A的ECOLIBL21在正常情况下的生长曲线
• 3.9.1 酵母中anti-RceIF-5A在正常条件下的生长
• 3.9.2含有重组质粒anti-RceIF-5A的酵母在高温情况下的生长
• 4 讨论
• 4.1 月季EIF-5A基因的获得与生物信息学分析
• 4.2月季EIF-5A基因在大肠杆菌和酵母中的功能研究
• 4.3月季EIF-5A基因在不同器官中的表达特性和SOUTHERN BLOT分析
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文