论文摘要
2型糖尿病主要特征是胰岛素抵抗及β细胞功能进行性衰竭,从而导致胰岛素效应不足,引起血糖的升高。来自英国前瞻性糖尿病研究中心的数据显示,尽管各种不同的治疗方案均能较好的控制血糖,但并不能阻止β细胞功能的进行性衰竭。越来越多的研究表明,胰淀素（Amylin）在β细胞功能衰竭的发展并最终导致高血糖的2型糖尿病中具有重要的作用。胰淀素是β细胞的一种正常分泌产物,与胰岛素由同一β细胞共同分泌和产生的,在生理量葡萄糖的刺激下二者按照1:100的比列相伴释放到胰岛β细胞外。但在高糖刺激下胰淀素的分泌远远超过胰岛素。高浓度的胰淀素一方面可抑制胰岛素的分泌,另一方面胰淀素在一定的条件下可自我聚集,沉积在胰岛中,破坏胰岛组织,损伤β细胞,以致功能衰竭。由于胰淀素与胰岛素是由编码基因启动子区域的β细胞特异性调控元件共同调节的,因此那些促进内源性胰岛素分泌的治疗药物很可能会引起胰淀素分泌的增加,而这样的变化是否足以影响其降糖的效应,或者影响糖尿病病程,并不是非常清楚。鉴于此,本课题选用了促胰岛素分泌的磺酰脲类药物和肠促胰岛素——胰高血糖素样肽-1为研究对象,通过整体和离体实验观察药物药效与胰淀素之间的相互关系,探讨胰淀素在2型糖尿病治疗中的作用,进一步揭示降糖药的分子作用机制。本课题得到了高等学校博士学科点专项科研基金的资助（项目号:20040246069）本课题主要的研究方法、结果及结论按二个部分分述如下:第一部分:磺酰脲类药物药效与胰淀素的关系;第二部分:GLP-1对胰淀素分泌和表达的影响第一部分:磺酰脲类药物药效与胰淀素的关系目的:考察大剂量磺酰脲类药物（sulfonylurea,SU）长期应用对小鼠糖代谢及胰岛功能的影响,研究胰淀素对SU药效的影响。方法:采用尾静脉注射四氧嘧啶制备糖尿病模型。正常和四氧嘧啶糖尿病小鼠灌胃给予格列本脲7.2mg/kg/d,格列齐特80mg/kg/d,每日2次,连续5周,每周测定体重和血糖;于给药5周末测定各组小鼠糖耐量变化;测定血清中胰淀素的浓度。在光镜下观察胰岛组织形态的变化。格列本脲灌胃给药1h后,尾静脉注射胰淀素,再腹腔注射葡萄糖,观察小鼠血糖峰值、血糖曲线下面积、葡萄糖增量及平均血糖增量的变化。离体原代培养胰岛细胞,将不同浓度的格列吡嗪加入细胞中孵育2h,ELASA法测定培养上清中胰岛素浓度。将不同浓度的胰淀素与格列吡嗪共同孵育在胰岛细胞中,测定培养上清中胰岛素浓度。结果:大剂量SU对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖的影响与正常组相比,四氧嘧啶模型组小鼠血糖明显升高（P＜0.001）,并且维持在整个实验过程,表明糖尿病模型制备成功。格列本脲3.6mg/kg（b.i.d）及格列齐特40mg/kg（b.i.d）连续灌胃给药5周,均没有观察到小鼠血糖的变化。提示,此模型并不适用于SU类药物药效的研究。因此,本实验在后续的试验中均以正常小鼠为观察对象。大剂量SU对正常小鼠血糖及糖耐量的影响以未治疗小鼠为对照组,格列本脲3.6mg/kg（b.i.d）在灌胃给药的第2周起表现出明显的降糖作用,在第3、4周仍然维持此作用,与对照组相比差异显著（P＜0.05,P＜0.01）,但在第5周时此降糖作用消失。提示,格列本脲3.6mg/kg（b.i.d）的给药模式持续5周,该药降低空腹血糖的效应减弱。格列齐特40mg/kg（b.i.d）对正常小鼠的血糖及糖耐量无明显的影响。SU对葡萄糖负荷正常小鼠胰淀素分泌的影响实验小鼠腹腔注射葡萄糖后胰淀素的分泌均有增加,但在未治疗组、格列本脲治疗组及格列齐特治疗组之间无显著性差异。提示,格列本脲及格列齐特大剂量给药5周后对胰淀素的分泌没有影响。胰淀素对SU降糖效应的的影响与未治疗组相比,胰淀素80μg/kg单独应用对小鼠的空腹血糖和葡萄糖的曲线下面积AUC没有明显的作用,但可显著降低血糖峰值和葡萄糖增量（P＜0.01）。这将有利于控制餐后血糖,减少血糖波动。与未治疗组相比,胰淀素80μg/kg可明显增强格列本脲3.6mg/kg降低正常小鼠空腹血糖的作用（P＜0.001）,使葡萄糖的曲线下面积AUC显著降低（P＜0.05）,改善糖耐量,表现出对格列本脲降糖作用的相加。与格列本脲、胰淀素合用组相比,胰淀素单用对葡萄糖增量的降低更为显著。这与合用组在糖负荷前较低的空腹血糖有关,表明胰淀素降血糖作用有一定的葡萄糖依赖性。胰淀素对SU促胰岛素分泌作用的影响在16.7mmol/L葡萄糖刺激下,格列吡嗪5.36μmol/L可明显增加胰岛素的释放（P＜0.01）,但当与不同浓度的胰淀素共同孵育时,其促胰岛素分泌作用发生了变化,1μM的胰淀素并未影响其作用,而5、10μM的胰淀素则明显抑制了胰岛素的释放,与格列吡嗪组相比差异显著（P＜0.05）。表明5、10μM的胰淀素在体外可减弱格列吡嗪的促胰岛素分泌作用。结论:格列本脲长期大剂量给药,可导致其降低正常小鼠空腹血糖的效应减弱,这一作用与胰淀素水平无明显的关系。胰淀素在体内增强磺酰脲类的降糖作用,在体外抑制其促胰岛素分泌作用。第二部分:GLP-1对胰淀素分泌和表达的影响目的:在2型糖尿病动物模型Goto-Kakizaki（GK）大鼠上,观察重组人胰高血糖素样肽-1（recombined human glucagon-like peptide 1,GLP-1）的降糖作用及对胰淀素分泌、表达的影响,探讨胰淀素与GLP-1降糖效应间的关系,并进一步从分子水平上阐明其作用机制。方法:以同周龄、同性别的Wistar大鼠为正常对照组,自发性糖尿病GK大鼠连续皮下注射给药GLP-1 56、133μg/kg 12周,定期测定血糖,在第11周,测定进食后30、60min的餐后血糖。在给药的第12周测定腹腔注射糖耐量,同时从眼静脉丛取血。用ELASA法测定血样中胰淀素浓度。处死大鼠取出胰腺,在光镜下观察GK大鼠胰岛基本形态结构的变化计数胰岛的数目。用免疫组化技术评价胰岛组织中胰淀素含量。用荧光定量PCR法测定胰淀素及胰岛素mRNA表达。结果:GLP-1对GK鼠血糖及糖耐量的影响以同周龄、同性别的Wistar大鼠为正常组,模型对照组的GK模型大鼠空腹及餐后血糖均明显高于正常对照组（P＜0.01）。GLP-1 56、133μg/kg能显著降低GK鼠餐后30、60min的血糖（P＜0.05）,改善糖耐量。但是对于空腹血糖,GLP-1 56、133μg/kg均没有明显的影响（P＞0.05）。GLP-1对血清中胰淀素水平的影响与正常组相比,模型对照组大鼠的胰淀素水平在空腹及糖负荷后均明显降低（P＜0.05,P＜0.01）。GLP-1治疗组大鼠的空腹胰淀素水平有下降的趋势,但与模型对照组相比无统计学意义。糖负荷后,GLP-1显著升高了GK大鼠的胰淀素水平（P＜0.05）。表明GLP-1改善了胰岛的分泌功能。GLP-1对胰岛细胞中胰淀素含量的影响正常组大鼠的胰岛内,可见强阳性、深棕色的胰淀素染色斑块,在胰岛细胞中广泛分布,几乎充满了整个胰岛。在模型对照组的GK大鼠中,只见少量的弱阳性染色散在的分布在胰岛中。而GLP-1治疗的GK大鼠则呈现出较多的胰淀素阳性染色细胞,染色强度也有所增加。提示,GLP-1增加了胰岛细胞中胰淀素的含量,与血清中水平的升高一致。GLP-1对胰岛组织形态和胰岛数目的影响模型对照组GK鼠的胰岛已不能保持规整圆形,表现为胰岛萎缩,边缘皱缩,并可观察到胰腺滤泡与胰岛交错生长。甚至失去胰岛结构,完全萎缩、崩解,与周围组织混合。GLP-1 56、133μg/kg治疗对胰岛结构均有所改善,胰岛的界限趋于清楚,外形趋于完整,核结构清晰,细胞排列整齐。表明GLP-1促进GK大鼠的胰岛结构逐步恢复和改善,但对胰岛数目无明显的影响（P＞0.05）。提示,GLP-1增加了胰淀素的分泌和表达,但这并没有影响其降糖的效应及对胰岛结构的改善。GLP-1对胰淀素及胰岛素mRNA表达水平的影响GK模型鼠胰岛中胰淀素及胰岛素的mRNA表达水平均显著降低（P＜0.01）,但胰淀素mRNA/胰岛素mRNA的比值远远大于正常组（P＜0.05）。GLP-1上调了胰淀素和胰岛素的mRNA表达水平,降低了胰淀素mRNA/胰岛素mRNA的比值。相关性分析显示,胰淀素mRNA水平及胰岛素的mRNA水平与血糖均呈现负相关,而胰淀素mRNA/胰岛素mRNA的比值与血糖呈现正相关。提示GLP-1对胰淀素mRNA/胰岛素mRNA比值的降低可能是其降糖的机制之一。结论:GLP-1增加了胰淀素的分泌和表达,但这并没有影响其降糖的效应及对胰岛结构的改善,分析其原因可能与GLP-1降低了胰淀素mRNA/胰岛素mRNA的比值有关。研究结果提示GLP-1及其类似物将是一类治疗2型糖尿病理想的候选药物。全文结论及创新点（一）全文结论1.格列本脲3.6mg/kg b.i.d连续给药5周,其降低空腹血糖的效应减弱。这一作用与胰淀素水平无明显的关系。2.胰淀素单用具有降糖作用,与SU联用降糖作用相加,但离体胰岛培养实验中胰淀素抑制SU的促胰岛素释放作用。表明胰淀素的降糖作用不依赖胰岛素的释放。3.GLP-1明显降低GK大鼠餐后血糖,改善糖耐量,连续给药8周未见耐受性,显示出良好的降糖效应。4.GLP-1能改善GK大鼠的胰岛结构,促进糖负荷后胰淀素的分泌,增加胰岛细胞中胰淀素的含量,改善了胰岛的分泌功能。提示,GLP-1引起的胰淀素水平的增加并没有影响到它的降糖效应及对胰岛结构的改善作用。5.GLP-1上调了胰淀素和胰岛素的mRNA表达水平,降低了胰淀素mRNA/胰岛素mRNA的比值。相关性分析显示,胰淀素mRNA水平及胰岛素的mRNA水平与血糖均呈现负相关,而胰淀素mRNA/胰岛素mRNA的比值与血糖呈现正相关。提示GLP-1对胰淀素mRNA/胰岛素mRNA比值的降低可能是其降糖的机制之一。（二）创新点1.首次在正常小鼠实验中观察到SU的降糖作用随着连续给药而减弱,对胰淀素水平无明显影响。2.首次在动物实验中观察到胰淀素与SU联用使降糖作用相加,表明胰淀素的降糖作用和SU的降糖作用是相互独立的。3.首次在2型糖尿病动物模型GK大鼠上观察到GLP-1促进了胰淀素的分泌,且长期用药降糖作用不产生耐受性。4.首次发现GLP-1同时上调了胰淀素和胰岛素的mRNA水平,但胰淀素mRNA/胰岛素mRNA的比值降低,逆转了糖尿病模型中胰淀素和胰岛素mRNA水平的变化,为GLP-1的临床应用提供了理论依据。5.研究表明胰淀素mRNA/胰岛素mRNA比值与血糖水平正相关,提出胰淀素mRNA/胰岛素mRNA比值的降低可能是一些降糖药的一条重要的作用机制,为开发、筛选新型降糖药提供了新思路。6.SU及GLP-1对胰淀素分泌的不同影响提示,胰淀素可能与SU的耐受性发生有关。同时本研究结果支持胰淀素对胰岛功能具有保护作用这一学术观点。
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