酱油添加酵母耐盐基因HOG1的研究

论文摘要

酱油中的主要风味物质大都是由发酵过程中添加的酵母产生,但是在酱油高盐稀态发酵中盐的浓度高达17%,致使酵母的代谢活性明显降低,这严重影响风味物质的形成,导致酱油质量下降。因此,本实验室应用基因组重排技术,以野生型T酵母为出发菌株构建了耐盐的优良酵母菌株T3-5。此外,因为目前对T酵母的基因组序列处于未知状态,而且对于T酵母和T3-5耐盐机制还不清楚。所以本文对T酵母（Torulopsis versatilis）和T3-5的耐盐基因HOG1进行研究,即在基因转录水平、基因的过量表达、DNA序列及蛋白质结构等分子水平上进行多角度的分析及比对,从而为阐明T酵母的耐盐机制奠定良好基础。本文通过半定量PCR（RT-PCR）对T酵母和T3-5在不同盐浓度下耐盐基因HOG1的RNA表达量进行了分析,研究发现,T3-5的HOG1表达量明显高于T酵母；继而对T酵母和T3-5的HOG1进行克隆测序,即分别将其PCR产物插入到测序载体pUC19中,构建质粒pUC19-T和pUC19-T5,测序结果发现T3-5的HOG1的碱基发生了突变；而后将测序结果翻译成氨基酸,并经NCBI比对,整理拼接后进行蛋白质的二级、三级结构预测,分析发现T和T3-5之间有两个明显的氨基酸差异,同时T3-5的蛋白等电点高于T酵母；最后,分别将T酵母和T3-5的HOG1目的基因片段插入到YEp195表达载体中,随后将所构建的质粒YEp195-T和YEp195-T3-5分别转入酿酒酵母实验室菌株W303-1A中,并对所构建的工程菌株进行耐盐度及其他指标分析,研究发现,菌株W-Y-T5的耐盐性强于W-Y-T,同时又都明显强于对照菌株W-Y。通过本文的研究表明：HOG1基因同样是T酵母渗透压调节机制中的关键基因；T3-5的HOG1基因转录水平增强是导致其耐盐性提高的一个重要原因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 酱油发酵
• 1.1.1 高盐稀态发酵工艺
• 1.1.2 低盐固态发酵工艺
• 1.1.3 固稀结合发酵工艺
• 1.2 酱油生产现状
• 1.2.1 国际酱油生产现状
• 1.2.2 国内酱油生产现状
• 1.3 提高酱油质量的方法
• 1.3.1 固定化技术
• 1.3.2 添加酶制剂
• 1.3.3 改造米曲霉
• 1.3.4 添加产香酵母
• 1.3.5 构建耐盐酵母
• 1.4 耐盐机制的理论基础
• 1.4.1 渗透休克反应
• 1.4.2 甘油代谢和水甘油通道蛋白
• 1.4.3 高渗透性甘油（HOG）的信号系统
• 1.4.4 转录反应
• 1.4.5 信号控制的研究
• 1.5 分子生物学及生物信息学
• 1.5.1 分子生物学的研究方法
• 1.5.2 生物信息学
• 1.6 本论文研究的目的、意义和主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 酶与试剂
• 2.1.3 仪器及设备
• 2.1.4 溶液与培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 RNA提取及反转录
• 2.2.3 酵母DNA的提取
• 2.2.4 测序质粒的构建
• 2.2.5 重组质粒pUC19-T-HOG1和pUC19-T3-5-HOG1的鉴定
• 2.2.6 测序结果与二、三级结构分析
• 2.2.7 表达质粒的构建
• 2.2.8 重组质粒YEp195-T-HOG1和YEp195-T3-5-HOG1转化至酵母W303-1A中
• 2.2.9 酵母阳性克隆菌株的鉴定
• 2.2.10 菌株WYTHOG1和WY5HOG1的比较
• 3 结果与讨论
• 3.1 HOG1基因的RNA表达量
• 3.1.1 RNA提取
• 3.1.2 反转录及半定量PCR
• 3.2 HOG1的测序
• 3.2.1 酵母DNA的提取
• 3.2.2 HOG1的PCR产物制备
• 3.2.3 PCR产物的纯化浓缩
• 3.2.4 产物与pUC19的双酶切
• 3.2.5 产物与pUC19的连接与转化
• 3.2.6 克隆子的提取与鉴定
• 3.3 测序结果与结构分析
• 3.3.1 基因测序结果分析
• 3.3.2 Hog1p蛋白氨基酸序列分析
• 3.3.3 Hog1p蛋白二、三级结构分析
• 3.4 酵母工程菌株的构建
• 3.4.1 质粒YEp195-T-HOG1和YEp195-T3-5-HOG1的构建
• 3.4.2 重组质粒YEp195-T3-5-HOG1和YEp195-T3-5-HOG1的鉴定
• 3.4.3 重组质粒和空白质粒分别转化至酵母W303-1A
• 3.4.4 酵母工程菌株的鉴定
• 3.5 过量表达Hog1p蛋白
• 3.5.1 细胞形态变化
• 3.5.2 耐盐性生长曲线变化
• 3.5.3 抗性变化
• 3.5.4 甘油产量变化
• 3.5.5 Hog1p的表达
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢