广西猪增生性肠炎病原的初步研究

论文摘要

猪增生性肠炎（PPE）是由胞内劳森氏菌（Lawsonia Intracellularis,LI）引起的接触性传染病,是一种具有重要经济意义的世界性疾病。该病呈全球性流行,国内临床可疑病例有增多趋势,猪群感染率高。胞内劳森氏菌宿主广泛,是猪肠道疾病综合征（PEDC）的关键性病原之一,对全球养猪业造成巨大经济损失。因此,了解PPE的流行情况并研究其病原,对防制该病和促进养猪业的健康发展具有重要意义。本研究优化了猪增生性肠炎的PCR诊断方法,能用于活体检测。从疑似病变的猪回肠中扩增出胞内劳森氏菌的基因,与GenBank上各株胞内劳森氏菌核苷酸同源性在98.9%～100%之间,证实广西猪群存在猪胞内劳森氏菌的感染;对广西猪群增生性肠炎调查显示,屠宰猪和断奶仔猪平均感染率分别为15.6%和13.5%,应引起重视。以感染猪回肠粘膜为材料,成功将本研究所得的GXNN株胞内劳森氏菌接种到兔体。动物感染试验表明,猪源胞内劳森氏菌可以用兔体接种保存,该菌可以人工感染小鼠;GXNN株胞内劳森氏菌对兔子和小鼠致病性相似,初步建立其动物感染模型。将GXNN株胞内劳森氏菌接种到猪后能复制出PPE,表明该菌是PPE的病原。对人工感染猪组织进行HE切片染色,证实胞内劳森氏菌可以引起猪回肠、结肠腺窝上皮细胞的增生。设计特异性引物,克隆GXNN株胞内劳森氏菌的16SrRNA基因。核苷酸同源性分析显示,GXNN株与不同动物源性胞内劳森氏菌16SrRNA核苷酸同源性在98.4%～100%;与其他种类原核微生物16SrRNA核苷酸同源性在71.8%～88.6%。克隆GXNN株胞内劳森氏菌的三个外膜蛋白基因和一个表面脂蛋白基因（LI1022,LI1024,LI0902,LI0235）,与已发表菌株AM180252核苷酸同源性分别为99.8%,99.5%,99.8%,99.8%;氨基酸同源性分别为99.4%,98.8%,99.3%,98.9%。分别将四个基因连接至PET32a+载体并转化至BL21,经酶切鉴定和序列测定后表明插入位置正确。分别挑取单个阳性菌落,于20℃下以终浓度1.0mmol/L IPTG诱导5h,并用抗6xHis标签单抗进行Westernblotting检测,结果表明PET32a+-LI1022、PET32a+-LI0902融合蛋白得到表达。用感染兔血清对PET32a+-LI1022融合蛋白进行Western blotting检测,初步表明该蛋白具有抗原性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 第一部分 前言
• 1.1 猪增生性肠炎研究进展
• 1.1.1 胞内劳森氏菌病原学
• 1.1.2 流行病学
• 1.1.3 致病机理与免疫反应
• 1.1.4 诊断与防控
• 1.2 研究目的和意义
• 1.3 研究路线
• 第二部分 实验研究
• 一 猪胞内劳森氏菌PCR检测方法的优化及广西猪增生性肠炎流行情况的初步调查
• 1.1 材料与试剂
• 1.1.1 检测样品
• 1.1.2 分子生物试剂
• 1.1.3 主要试剂的配制
• 1.1.4 引物设计
• 1.2 方法与步骤
• 1.2.1 DNA的抽提
• 1.2.2 PCR扩增与胶回收
• 1.2.3 基因克隆
• 1.2.4 基因测序
• 1.2.5 DNA抽提方法比较
• 1.2.6 临床检测
• 1.3 结果
• 1.3.1 PCR诊断及重组子酶切鉴定
• 1.3.2 序列测定及核苷酸同源性比较结果
• 1.3.3 病料保存及序列提交
• 1.3.4 DNA抽提方法比较结果
• 1.3.5 临床检测结果
• 1.4 小结与讨论
• 二 猪胞内劳森氏菌动物感染模型的初步建立及猪增生性肠炎的复制
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 病料
• 2.1.2 试验动物
• 2.1.3 主要试剂及饲料配方
• 2.2 方法与步骤
• 2.2.1 猪源胞内劳森氏菌在兔体中接种保存
• 2.2.2 动物感染模型的初步建立
• 2.2.3 猪增生性肠炎的复制
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 猪源胞内劳森氏菌在兔体中接种保存
• 2.3.2 胞内劳森氏菌在兔体中接种传代及对兔子的致病性分析结果
• 2.3.3 胞内劳森氏菌在小鼠中接种及对小鼠的致病性分析结果
• 2.3.4 猪增生性肠炎的复制结果
• 2.4 小结与讨论
• 三 人工感染猪增生性肠炎组织病理学初步研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料来源
• 3.1.2 HE染色试剂及配制
• 3.1.3 方法与步骤
• 3.2 结果
• 3.3 小结与讨论
• 四 猪胞内劳森氏菌GXNN株16srRNA基因的扩增及其分类探讨
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 病料与试剂
• 4.1.2 引物设计
• 4.2 方法与步骤
• 4.2.1 DNA抽提与 PCR扩增
• 4.2.2 PCR产物克隆与酶切鉴定
• 4.2.3 基因测序
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 PCR扩增及重组子的酶切鉴定结果
• 4.3.2 16SrRNA序列测定及核苷酸同源性比较结果
• 4.3.3 16SrRNA高变区序列比较
• 4.3.4 种系发生关系
• 4.4 小结与讨论
• 五 猪胞内劳森氏菌GXNN株抗原性候选基因的克隆与原核表达及Western blotting 分析
• 5.1 材料与试剂
• 5.1.1 病料与菌株
• 5.1.2 引物设计
• 5.1.3 分子生物学试剂与材料
• 5.1.4 SDS-PAGE及Western blotting试剂及配制
• 5.2 方法与步骤
• 5.2.1 猪胞内劳森氏菌GXNN株抗原性候选基因的克隆
• 5.2.2 抗原性候选基因原核表达载体的构建
• 5.2.3 诱导表达与SDS-PAGE电泳
• 5.2.4 Western blotting检测
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 猪胞内劳森氏菌GXNN株抗原性候选基因克隆及序列分析结果
• 5.3.2 候选抗原基因原核表达载体的构建结果
• 5.3.3 抗原性候选基因诱导表达及SDS-PAGE电泳结果
• 5.3.4 Western blotting蛋白检测结果
• 5.3.5 Western blotting抗原性分析结果
• 5.4 小结与讨论
• 六 结论
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 论文发表情况