论文摘要
研究目的:体外培养人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC),用PDGF诱导增殖,研究法舒地尔对PDGF诱导增殖的HPASMC的抑制作用、机制及其对HPASMC的促凋亡作用,为临床应用法舒地尔治疗肺动脉高压提供实验依据。研究方法:1.通过形态学、MTT、流式细胞仪、Western blot等方法研究PDGF对HPASMC的促增殖作用,及对Rho A/ROCK信号通路、ERK信号通路及p27kiP1的影响;2.通过MTT、流式细胞仪、Western blot、TUNEL等方法研究法舒地尔对PDGF诱导的HPASMC增殖的抑制作用、对Rho A/ROCK信号通路、ERK信号通路及p27kiP1的影响及对HPASMC的促凋亡作用。研究结果:1.从形态学上观察法舒地尔可以抑制PDGF诱导的HPASMC增殖;用MTT检测,在培养24 h后,PDGF能显著诱导HPASMC增殖,法舒地尔预处理则能显著抑制PDGF的促HPASMC增殖作用,并呈浓度依赖性;Western blot检测,PDGF作用24 h后能显著上调PCNA表达,法舒地尔预处理则能显著下调PDGF诱导的PCNA高表达。2.流式细胞仪检测细胞周期,在培养24 h后,PDGF能显著诱导正常HPASMC由G1期向S期转化;法舒地尔预处理则对PDGF诱导增殖的HPASMC有G1期阻滞作用,这种阻滞作用呈浓度依赖性。3.用台盼蓝染色检测法舒地尔对HPASMC的细胞毒性,结果显示不同浓度的法舒地尔(0、10、30、50、100 umol/1)作用24 h后,HPASMC的细胞存活率与对照组比较无统计学差异。4.用Western-blot法检测发现PDGF作用后能增加ROCK的酶活性,并在15min达到最高峰;用法舒地尔预处理可以显著降低PDGF诱导的ROCK酶活性,并呈浓度依赖性。5.用Western-blot法检测ERK蛋白的表达,发现PDGF作用后能显著增强ERK活性,法舒地尔预处理则能显著抑制PDGF诱导的ERK高表达。6.用Western-blot法检测p27Kip1蛋白的表达,发现PDGF作用后能显著下调p27Kip1蛋白的表达,法舒地尔预处理则可以显著上调PDGF作用后p27Kipl的低表达。7.用流式细胞仪和TUNEL法检测发现法舒地尔预处理后,HPASMC的细胞凋亡率无显著性变化。结论:PDGF对体外培养的HPASMC有促增殖作用,Rho A/ROCK信号通路在PDGF诱导的HPASMC增殖过程中起着重要的作用;法舒地尔可以通过抑制ROCK活性抑制PDGF诱导的HPASMC增殖;法舒地尔对体外培养、PDGF诱导增殖的HPASMC有G1期阻滞作用;法舒地尔的抑制增殖作用主要是通过上调p27Kip1的蛋白表达实现的,ERK信号通路可能参与调节p27Kip1蛋白的表达;法舒地尔对PDGF诱导增殖的HPASMC没有促凋亡的作用。
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