三种基于逆转座子分子标记技术体系的建立及其在苹果芽变鉴定中的应用

论文摘要

逆转座子通过RNA为中介进行转座,在植物基因组中分布广泛,拷贝数多,异质高,在种内和种间表现出较高的序列差异性和丰富的插入多态性,而且其引起的突变为稳定突变,针对这些特点开发出的几种分子标记与常规分子标记比较,其优势在于能覆盖全基因组,揭示的多态性更丰富,在遗传多样性和系谱研究、遗传连锁图谱构建及性状基因定位方面具有很大的发展潜力。苹果（Malus）是果树中最易发生芽变的树种之一。目前生产上广泛应用的许多优良品种和品系都是通过芽变选种获得的,全世界苹果总产量中大约有一半左右来源于芽变品种。芽变在苹果的优良品种的选育上起着极其重要的作用。但是常规方法来鉴别苹果芽变品种相对困难,本文通过建立和优化的苹果IRAP、REMAP标记体系并结合SSAP标记对苹果芽变品种进行鉴定,主要研究结果如下:1通过苹果逆转座子长末端重复序列（LTRs）保守区域设计引物,对影响苹果IRAP和REMAP反应体系的重要因素进行了研究:建立并优化了苹果IRAP和REMAP分子标记技术体系。优化的苹果IRAP标记体系为:25μL反应体系中,模板DNA 50ng、25mmol/LMgCl2 2.5μL、dNTP 2.0μL、10×Buffer 2.5μL、Taq DNA聚合酶1.0U、10μmol/L引物0.8μL。优化的苹果REMAP标记体系为:基因组DNA 50ng、25mmol/L MgCl22.5μL、dNTP 2.0μL、10×Buffer 2.5μL、Taq DNA聚合酶1.0U、10μmol/L LTR引物0.8μL、10μmol/L ISSR引物0.8μL。2通过建立的IRAP和REMAP标记体系对苹果富士系和元帅系芽变品种进行了鉴定,利用SSAP技术对苹果富士系芽变品种进行了鉴定。结果表明:IRAP分析中引物L7在富士系芽变中具有多态性,引物L1在元帅系芽变上具有多态性;REMAP分析中仅有引物组合L1/P5在富士系芽变品种中表现出一定的多态性;SSAP技术对苹果普通富士及其14个芽变品种进行的研究中,从60对引物中筛选出的6对引物中,L12/E7能够将所有富士芽变品种同母本区分开来,其余5对引物能够在芽变品种中区分秋富5号、烟富1、盛放富1和长富1号。由于SSAP多态性主要来源基因组内逆转座子的转座,因此,富士苹果芽变品种的产生可能与逆转座子的插入引起的转座有关,同时也为新品种的选育提供早期鉴定方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词（Abbreviation）
• 第一章 文献综述
• 1 逆转座子简述
• 1.1 逆转座子的类型和结构
• 1.2 逆转座子的分布
• 1.3 逆转座子的特点
• 1.3.1 高度异质性
• 1.3.2 纵向传递和横向传递
• 1.3.3 高拷贝数
• 1.3.4 逆转座子的活性
• 1.4 基于逆转座子的分子标记
• 1.4.1 SSAP
• 1.4.2 IRAP
• 1.4.3 REMAP
• 1.4.4 RIVP
• 1.4.5 RBIP
• 1.5 基于逆转座子的分子标记的应用
• 1.5.1 遗传多样性和系统进化研究
• 1.5.2 构建遗传连锁图谱和标记重要农艺性状
• 1.5.3 芽变品种鉴定
• 2 果树芽变及其研究进展
• 2.1 芽变及其特点
• 2.2 芽变发生机理研究
• 2.3 苹果芽变的主要类型
• 2.4 常见的芽变鉴定方法
• 2.4.1 形态学及解剖学观察
• 2.4.2 同工酶分析
• 2.4.3 染色体观察
• 2.4.4 孢粉学研究
• 2.4.5 分子标记
• 3 本研究的目的和意义
• 第二章 苹果IRAP和REMAP分子标记技术体系的建立
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 模板DNA的制备
• 1.2.2 DNA的检测与定量
• 1.2.3 引物设计和合成
• 1.2.4 IRAP-PCR体系和参数设置
• 1.2.5 PCR产物检测
• 2 结果与分析
• 2.1 苹果基因组DNA的提取
• 2.2 IRAP-PCR扩增程序的建立
• 2+浓度对IRAP体系的影响'>2.2.1 不同Mg²⁺浓度对IRAP体系的影响
• 2.2.2 不同dNTP浓度对IRAP体系的影响
• 2.2.3 不同TaqDNA浓度对IRAP体系的影响
• 2.2.4 不同引物浓度对IRAP体系的影响
• 2.2.5 不同退火温度对IRAP体系的影响
• 2.2.6 部分苹果品种指纹图谱的构建
• 2.3 苹果REMAP标记体系的建立
• 3 讨论
• 第三章 苹果芽变品种的IRAP、REMAP和SSAP
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 基因组DNA的提取
• 1.3 IRAP分析
• 1.4 REMAP分析
• 1.5 SSAP分析
• 1.5.1 基因组DNA的酶切
• 1.5.2 接头的变性与退火
• 1.5.3 连接反应
• 1.5.4 预扩增反应
• 1.5.5 选择性扩增
• 1.5.6 银染分析
• 1.5.7 数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 苹果基因组DNA的提取
• 2.2 IRAP分析结果
• 2.3 REMAP分析结果
• 2.4 SSAP分析结果
• 2.4.1 基因组DNA质量及酶切连接效果
• 2.4.2 选择性扩增
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录:图版
• 致谢