用基于SNP分型的实时PCR定量检测造血干细胞移植后的嵌合体

论文摘要

【背景】 造血干细胞移植是目前临床上治疗白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、重型再生障碍性贫血和地中海贫血等血液系统疾病的最有效手段之一。根据造血干细胞的来源可以分为自体、异体同基因（如双胞胎）、以及异基因（如父母、同胞或无血缘关系的供者）移植。随着移植理论和技术的进步，以及骨髓库的完善，HLA相合或半相合的异基因造血干细胞移植在临床上的应用越来越广泛。异基因干细胞移植的目的是建立供者型的正常造血与免疫功能，以取代受者原有的异常的造血及免疫系统。为判断移植是否成功并及时地实施免疫抑制治疗、预后等，人们需要对移植后受体体内形成的供、受者外周血细胞嵌合体进行检测并观察其变化趋势。此外，嵌合体分析还可为移植相关的其他免疫学研究提供良好的实验手段。 从遗传学的角度来说，异基因的供受者外周血细胞嵌合体本质上是两个基因型不同的个体之细胞的混合物。因此，利用人体染色体上的一些遗传标记可以区分供受者细胞并对供受者细胞的比例进行定量分析。传统的嵌合体分析手段包括基于第一代和第二代遗传标记检测的RFLP-PCR和VNTR／STR-PCR技术，以及基于染色体片段分析的FISH技术，这些方法存在着一些局限性，如灵敏度低（如STR-PCR仅能达到5％-1％），应用面窄（如FISH仅能用于性别不合的供受者）等缺陷。近年来，随着嵌合体分析在白血病复发及白血病微残余灶监测上的广泛应用，临床实践对嵌合体分析技术的检测灵敏度和定量的精确性也提出了更高的要求。 SNP做为第三代遗传标记较RFLP、VNTR／STR有不可取代的优势：①SNP

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 第2章 文献回顾
• 第3章 实验材料
• 2.1 仪器
• 2.2 试剂
• 2.3 样品
• 2.4 生物学软件及数据库
• 第3章 实验方法
• 3.1 技术路线和技术原理
• 3.1.1 本研究的技术路线
• 3.1.2 技术原理
• 3.2 模板DNA的制备
• 3.2.1 样品DNA的提取
• 3.2.2 DNA浓度的测定
• 3.3 SNP的选择和引物的设计
• 3.4 基于SNP基因分型的定性检测
• 3.4.1 实时PCR扩增和基因型分析
• 3.4.2 测序验证
• 3.4.3 各SNP位点等位基因频率的测定
• 3.5 基于SNP基因分型的定量检测
• 3.5.1 硫代引物在分型与定量分析中的应用
• 3.5.2 定量体系的建立
• 3.6 临床标本的分析
• 第4章 实验结果
• 4.1 DNA样品的质量
• 4.2 基于SNP基因分型的定性检测结果
• 4.2.1 SNP位点的基因分型
• 4.2.2 人群中各SNP位点等位基因频率测定
• 4.2.3 测序验证
• 4.3 基于SNP基因分型的定量检测结果
• 4.3.1 硫代引物反应体系的建立
• 4.3.2 基因分型定量检测结果
• 4.4 临床样品的定量检测结果
• 第5章 讨论
• 5.1 SNP的选择及分型
• 5.2 基于SNP分型的定量检测技术
• 5.3 模板的质量要求及有效上样量
• 5.4 该法的临床应用范围和使用注意事项
• 5.5 展望
• 第6章 参考文献
• 附录：英文缩写词中英文对照表
• 致谢
• 原创性声明