心肌肥大时NAD(P)H氧化酶的差异表达及阿伐他汀的干预作用

论文摘要

目的：检测肾性高血压心肌肥大时NAD（P）H氧化酶调节亚型P47phox和催化亚基NOX家族不同亚型的表达变化，观察阿伐他汀对心肌肥大的防治作用以及与NAD（P）H氧化酶相关的抗氧化机制。方法：采用两肾两夹法（two-kidneytwo-clip,2K2C）建立肾血管性高血压大鼠模型，术后4周筛选出符合要求的高血压大鼠进行实验。实验分两部分，第一部分实验检测不同时期NAD（P）H氧化酶的差异表达，共分6组，每组10只：假手术4周组（S4）；模型4周组（K4）；假手术8周组（S8）；模型8周组（K8）；假手术12周组（S12）；模型12周组（K12）。第二部分实验检测阿伐他汀干预作用，共分5组，每组10只大鼠：（1）假手术组（Sham）：假手术大鼠，每天灌胃给予等量的生理盐水；（2）模型组（2K2C）:2K2C手术的高血压大鼠，每天灌胃给予等量的生理盐水；（3）阿伐他汀高剂量组（AtoH）：2K2C手术的高血压大鼠，每天灌胃给予10mg/kg剂量的阿伐他汀；（4）阿伐他汀低剂量组（AtoL）：2K2C手术的高血压大鼠，每天灌胃给予5mg/kg的阿伐他汀；（5）坎地沙坦组（Can）：2K2C手术的高血压大鼠，每天灌胃给予10mg/kg的坎地沙坦，每周测体重，按体重调整用药剂量，共给药4周。手术前、给药前后用尾动脉测压法测量血压。实验结束时，颈动脉插管至左心室检测血流动力学参数，处死大鼠、腹主动脉采血、取左心室称重，计算左心室体质量指数；取部分左心室行HE和MASSON染色；其余部分冻于-80℃冰箱做以下实验：取部分心肌和主动脉作冰冻切片，用DHE孵育后在共聚焦显微镜下观察活性氧产生，记录荧光强度并进行各组间比较；应用Western Blot和PCR方法检测胚型基因ANF、BNP、-MHC以及NAD（P）H氧化酶的催化亚基NOX家族的不同亚型NOX2、NOX4和调节亚基p47phox的蛋白表达和mRNA转录的变化。结果：（1）术后4周，2K2C组大鼠较Sham组AoSP、AoDP、LVESP、LVEDP以及LVW/BW显著升高，而±dp/dtmax显著降低；ANF、BNP、-MHC等肥大因子表达明显上升，观察4、8、12周ANF、BNP、-MHC的表达情况，发现其表达增加呈时间依赖性。（2）4周时，2K2C大鼠NAD（P）H氧化酶的催化亚基NOX家族的不同亚型NOX2、NOX4和调节亚基p47phox的蛋白表达和mRNA转录水平已有明显上升，在8周、12周时上升情况更加显著。（3）阿伐他汀和坎地沙坦治疗4周后，发现二者能显著升高±dp/dtmax，坎地沙坦可以明显降低各项血压指标，而阿伐他汀无论低剂量还是高剂量都无明显降血压作用。（4） HE染色显示模型组大鼠左心室呈明显的肥厚生长，MASSON染色显示心肌血管周胶原面积（PVCA）明显增大。阿伐他汀和坎地沙坦治疗4周能够显著抑制这些变化，并且阿伐他汀高剂量组效果好于阿伐他汀低剂量组。（5）2K2C组大鼠心室肌中活性氧产生明显增多，给予阿伐他汀和坎地沙坦后，发现心肌组织中的活性氧含量明显下降，氧化应激状态减轻。（6） RT-PCR和Western blot结果显示2K2C组大鼠心肌中NOX2、NOX4和P47phox表达水平明显上调，给予阿伐他汀和坎地沙坦后， NOX2、NOX4和P47phox的表达受到抑制，且阿伐他汀呈剂量依赖性降低NOX2、NOX4和P47phox的表达。结论：（1） NAD（P）H氧化酶参与肾性高血压心肌肥大的发生与发展过程。（2）阿伐他汀和坎地沙坦能显著抑制NAD（P）H氧化酶亚基NOX2、NOX4和P47phox的高表达，这可能是其抑制心肌肥大的机制之一。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 综述
• 1.1 引言
• 1.2 NAD（P）H 氧化酶的结构和亚型
• 1.3 NAD（P）H 氧化酶与心肌肥大
• 1.4 NAD（P）H 氧化酶与心肌间质纤维化
• 1.5 NAD（P）H 氧化酶与心脏收缩功能异常
• 1.6 NAD（P）H 氧化酶与心肌细胞凋亡
• 第2章 前言
• 第3章 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 仪器与设备
• 3.1.4 试剂的配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 两肾两夹肾性高血压大鼠模型的建立
• 3.2.2 分组
• 3.2.3 血压测量
• 3.2.4 心室体质量指数测定
• 3.2.5 血流动力学参数测定
• 3.2.6 HE 染色观察心肌形态学变化
• 3.2.7 心肌组织 MASSON 染色
• 2^-产生'>3.2.8 共聚焦显微镜检测心室肌中 O₂^-产生
• 3.2.9 Western-blot 检测 NAD（P）H 氧化酶亚基蛋白表达
• 3.2.10 RT-PCR 检测检侧 NAD（P）H 氧化酶亚基 mRNA 转录
• 3.2.11 统计学方法
• 第4章 结果
• 4.1 心肌肥大不同时期 NAD（P）H 氧化酶的差异表达
• 4.1.1 各组大鼠血流动力学参数及左室体质量指数的变化
• 4.1.2 心肌肥大时 ANF、BNP、 -MHC 的变化
• 4.1.3 心肌肥大时心室肌形态学的变化
• 4.1.4 心肌肥大时亚型 P47phox、NOX2、NOX4 的 mRNA 转录变化
• 4.1.5 心肌肥大时 NAD（P）H 氧化酶亚型 P47phox、NOX4 的蛋白表达变化
• 4.2 阿伐他汀对心肌肥大及 NAD（P）H 氧化酶的作用
• 4.2.1 阿伐他汀对各组大鼠血流动力学参数和心室体质量指数的影响
• 4.2.2 阿伐他汀对各组大鼠心室肌形态学的影响
• 4.2.3 阿伐他汀对各组大鼠心室肌中肥大因子表达的影响
• 2·^–产生的影响'>4.2.4 阿伐他汀对各组大鼠心室肌中 O₂·^–产生的影响
• 4.2.5 阿伐他汀对大鼠心室肌 NAD（P）H 氧化酶 mRNA 及蛋白表达的影响
• 第5章 讨论
• 5.1 高血压大鼠模型的选择
• 5.2 2K2C 肾性高血压大鼠心肌肥大发展的评价
• 5.3 2K2C 肾性高血压大鼠心肌肥大及氧化应激的变化
• 5.4 2K2C 肾性高血压大鼠心肌中 NAD（P）H 氧化酶亚型表达的变化
• 5.5 坎地沙坦能降低血压并延缓心肌肥大的发展
• 5.6 阿伐他汀不依赖降低血压延缓心肌肥大的发展
• 第6章 结论
• 参考文献
• 缩略语词汇表
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果