粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆及表达

论文摘要

乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase, ACC）是脂肪酸合成代谢中的关键酶,它催化乙酰辅酶A生成丙二酰单酰辅酶A,后者是脂肪酸合成中二碳单位的供体,因此乙酰辅酶A羧化酶也成为脂肪酸合成代谢中的限速酶,被广泛应用于转基因油料作物研究中。本研究主要结果如下：利用简并PCR和染色体步移法首次克隆获得产油粘红酵母（Rhodotorula glutinis） ACC基因的全长序列信息。序列分析表明,该基因包含两个内含子,分别位于42-147 bp和315-677 bp处,编码区域总长为6801 bp,推导的氨基酸序列进行二级结构分析具备乙酰辅酶A羧化酶典型的三个功能域：生物素羧化酶（BC）、生物素羧基载体蛋白（BCCP）和羧基转移酶（CT）。粘红酵母中ACC为多功能单亚基型酶,单体分子量在200 kD以上,从整体角度对编码该酶的基因进行异源表达十分困难,因此仿效多亚基型ACC的研究方法对粘红酵母ACC的功能域基因进行研究。本文分别利用两套原核表达体系pET-28a/BL21 （DE3）和pETDuet-1/Transetta （DE3）对粘红酵母ACC的三个功能域基因进行了独立表达和共表达,成功构建了9个表达载体。SDS-PAGE分析表明三个功能域基因在两套表达体系中均成功实现了单独表达,并且还实现了BC和CT两个功能域的共表达以及三个功能域的共表达。所有重组表达菌株利用水浴法抽提脂肪酸后进行气相色谱分析,结果如下：在pETDuet-1/Transetta （DE3）表达系统中,独立表达功能域BC或CT,共表达BC和CT二者及共表达BC、BCCP和CT三者获得的重组菌株较对照脂肪酸含量分别提高了15.4%、27.07%、35%、70.62%,只有单独表达功能域BCCP的重组菌株脂肪酸含量下降5.06%。而在pET-28a/BL21（DE3）表达体系中,重组表达菌株的脂肪酸含量较对照没有任何提高。由此证明在pETDuet-1/Transetta （DE3）表达系统中外源基因实现了功能性表达,BC和CT独立表达或共表达均能不同程度地提高脂肪酸含量,当三个功能域实现共表达时显著促进脂肪酸的积累。本研究还利用SOE-PCR去除了粘红酵母ACC基因内的两个内含子,并将ACC的cDNA全长分为三个片段：EK、KS、SX,依次连接到毕赤酵母表达载体pPICZaA上,构建了ACC全长表达载体,为后续真核表达和功能研究奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1前言
• 1.1 植物油脂代谢研究
• 1.1.1 饱和脂肪酸合成基因工程
• 1.1.2 脂肪酸去饱和酶基因工程
• 1.1.3 三酰甘油组装酶基因工程
• 1.2 乙酰辅酶A羧化酶（ACC）简介
• 1.2.1 ACC的分类
• 1.2.2 ACC的生物学功能及表达调控
• 1.2.2.1 动物组织中ACC的功能与应用
• 1.2.2.2 植物组织中ACC的功能与应用
• 1.2.2.3 微生物组织中ACC的功能与应用
• 1.2.2.4 ACC的表达调控
• 1.2.3 ACC抑制剂及机理研究
• 1.2.3.1 动物ACC抑制剂及作用机理
• 1.2.3.2 植物除草剂及作用机理
• 1.2.3.3 其它类型ACC抑制剂及作用机理
• 1.3 乙酰辅酶A羧化酶基因克隆及基因工程研究进展
• 1.3.1 异质型ACC基因克隆及基因工程研究进展
• 1.3.2 同质型ACC基因克隆及基因工程研究进展
• 1.4 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要仪器及试剂
• 2.1.3.1 主要仪器
• 2.1.3.2 主要试剂
• 2.2 粘红酵母ACC基因的克隆
• 2.2.1 引物设计、合成及测序
• 2.2.2 粘红酵母基因组DNA的提取
• 2.2.3 简并引物克隆ACC基因部分基因组DNA序列
• 2.2.4 大肠杆菌E.coli DH5α感受态的制备
• 2.2.5 转化
• 2.2.6 阳性克隆子的筛选
• 2.2.7 Genome walking酶切文库的构建
• 2.2.8 Genome walking酶切文库连接Adaptors
• 2.2.9 基于PCR的染色体步移法
• 2.3 粘红酵母ACC三个功能域基因的独立表达
• 2.3.1 粘红酵母总RNA的提取
• 2.3.2 粘红酵母ACC三个功能域基因的克隆
• 2.3.3 PCR产物的纯化
• 2.3.4 重组质粒的抽提
• 2.3.5 双酶切重组质粒
• 2.3.6 切胶回收目的片段
• 2.3.7 粘红酵母ACC三个功能域基因原核表达载体的构建
• 2.3.8 转化宿主菌株
• 2.3.9 目的蛋白的诱导表达
• 2.4 粘红酵母ACC三个功能域基因的共表达
• 2.4.1 共表达的三个功能域基因的克隆
• 2.4.2 共表达载体的构建
• 2.4.3 转化表达菌株
• 2.4.4 目的蛋白的诱导表达
• 2.5 重组表达菌株脂肪酸含量的测定
• 2.6 粘红酵母ACC cDNA全长表达载体的构建
• 2.6.1 粘红酵母ACC基因的编码区域的分段扩增
• 2.6.2 毕赤酵母表达载体pPICZα-EK-KS-SX的构建
• 3 结果与分析
• 3.1 粘红酵母ACC基因的克隆
• 3.1.1 乙酰辅酶A羧化酶氨基酸序列的比对分析
• 3.1.2 粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因部分序列的克隆
• 3.1.3 基于PCR技术的染色体步移
• 3.2 粘红酵母ACC三个功能域基因的独立表达
• 3.2.1 粘红酵母总RNA的获得
• 3.2.2 粘红酵母ACC三个功能域基因的克隆
• 3.2.3 粘红酵母ACC三个功能域基因独立表达载体的构建及验证
• 3.2.4 粘红酵母ACC三个功能域基因的独立表达
• 3.3 粘红酵母ACC三个功能域基因共表达
• 3.3.1 共表达载体的构建及验证
• 3.3.2 SDS-PAGE电泳检测三个功能域基因的共表达
• 3.4 脂肪酸分析
• 3.5 粘红酵母ACC cDNA全长表达载体的构建
• 4 讨论
• 4.1 长片段未知基因的克隆
• 4.2 不同表达条件对蛋白活性的影响
• 4.3 粘红酵母ACC三个功能域基因对脂肪酸合成的影响
• 5 总结与展望
• 5.1 总结
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间已发表的论文