精子介导的乙肝病毒基因在早期鼠胚中的复制与表达

论文摘要

【背景与目的】 乙型肝炎是危害人类健康的全球性疾病。我国是该病高发区,乙肝病毒携带者约占全国人口的10%。由于该病危害性大,流行面广,因此其传播途径、发病机理及诊疗手段的研究一直是各国政府和科学家们高度重视的课题。1985年Hadchouel等发现乙肝患者的精子基因组中存在HBV DNA序列整合,提出“乙肝病毒有可能通过生殖细胞垂直传播”的假设。但10多年来,相关研究由于没有适用的实验动物与细胞培养模型而止步不前。2002年黄建民等应用人精子/金黄地鼠去透明带卵异种体外受精和荧光原位杂交技术,证实染色体上整合了HBV DNA序列的人精子能够与卵母细胞正常地完成受精过程。Ali等也在离体实验中发现由精子携带的HBV基因能够在早期胚胎中复制和转录。本研究首次从活体动物的整体效应探讨携带了HBV DNA的精子能否顺利完成受精过程,以及通过受精由精子携带到胚胎的HBV基因能否进行复制、转录和蛋白水平的表达,以期为HBV真正意义上的父婴垂直传播途径提供直接证据。【材料与方法】 1)材料①pBR322-HBV DNA质粒;②精子,取自性成熟金黄地鼠与昆明小鼠附睾;③早期胚胎,取自雌性金黄地鼠和昆明小鼠输卵管。 2)方法①双侧睾丸内注射HBV DNA质粒;②用PCR、Southern杂交、斑点杂交和荧光原位杂交技术（FISH）证实HBV DNA是否进入精子细胞并与精子细胞基因组整合;③收集受精卵、2-细胞胚胎,制备间期核片,用FISH检测HBV DNA在间期核上的整合与复制;④收集2-细胞胚胎,用RT-PCR检测HBx与HBs基因在胚胎细胞中的转录;⑤收集2-细胞期胚胎,用免疫荧光技术检测HBsAg蛋白在胚胎细胞中的表达。【结果】①PCR、Southern在精子样本中可见HBx基因阳性带,洗涤液样本斑点杂交结果阴性,排除了PCR和Southern阳性结果来自洗液污染的可能性;②FISH在精子核、受精卵中雄原核、2-细胞胚中两个间期核观察到HBV DNA阳性杂交信号;③RT-PCR 2-细胞胚样本可见HBx和HBs基因特异带;④免疫荧光检测 在2-细胞胚细胞浆内观察到HBsAg阳性表达。【结论】①HBV基因能够通过精子膜进入精子细胞内并整合到精子基因组内;②携带有HBV基因的精子在自然受精时能够将病毒基因带入胚胎中;③由精子带入的HBV基因能够在早期胚胎中复制、转录和表达。④本研究为HBV可经过雄性生殖细胞垂直传递提供了直接的科学证据。⑤本研究为在其他病毒性传染病中进行类似研究提供一个理想的实验模型,进而有可能为临床医学基础研究展开一个新的领域。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• 英文摘要
• 主要缩略语中英文对照表
• 前言
• 技术路线
• 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 实验动物处理和样本收集
• 2.2 质粒和探针制备
• 2.3 实验程序
• 结果与讨论
• 第一部分 肇丸直接注射体内转染 HBV动物模型的建立
• 1.1 结果
• 1.2 讨论
• 第二部分 乙肝病毒 DNA在小鼠早期胚胎中复制与表达的鉴定
• 2.1 结果
• 2.2 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 附录 主要混合液及培养基
• 致谢
• 综述