湖南衡阳南华大学医学院421001
【摘要】目的：研究人型支原体（Mh）编码II型拓扑异构酶的基因喹诺酮耐药决定区（QRDR）突变与莫西沙星耐药的关系。方法：对喹诺酮类药物敏感的Mh临床分离株用莫西沙星进行耐药诱导培养，使之产生第一代和第二代耐药突变株。检测莫西沙星对Mh标准株、临床分离株、第一代和第二代耐药突变株的最低抑菌浓度（MIC），并对这些菌株的QRDR进行PCR扩增后测序。结果：第一代耐药突变株均在编码拓扑异构酶IV的基因的QRDR上发生了点突变；第二代耐药突变株则在继承了前代的点突变之后，均在编码DNA促旋酶基因的QRDR上发生了不同的点突变。结论：QRDR的点突变可导致Mh对莫西沙星产生耐药；莫西沙星对Mh的首要靶酶是拓扑异构酶IV。
【关键词】人型支原体，莫西沙星，喹诺酮耐药决定区，突变，耐药
【中图分类号】R518.9【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2016）09-023-01
人型支原体是存在于人类泌尿生殖道的重要条件致病病原体，主要引起泌尿生殖道感染，也可引起附睾炎、宫颈炎和盆腔感染性疾病等生殖道外感染。氟喹诺酮类药物是人工合成的抗菌药物，在临床上广泛用于治疗由Mh引起的疾病。喹诺酮通过抑制微生物II型拓扑异构酶活性阻碍DNA复制。II型拓扑异构酶包括DNA促旋酶和拓扑异构酶IV。DNA促旋酶是由gyrA和gyrB基因分别编码而成的两个A亚基（即GyrA）和两个B亚基（即GyrB）组成的四聚体A2B2；拓扑异构酶IV是由parC及parE基因编码而成的两个C亚基（即ParC）和两个E亚基（即ParE）组成的四聚体C2E2[1]。微生物在合成DNA的过程中，DNA促旋酶A亚基将一条DNA双链（G片段）打断，形成两个缺口，接着B亚基使另一条DNA双链（T片段）从中通过，随后A亚基再将两个缺口封住，使正超螺旋变为负超螺旋。拓扑异构酶IV作用机制与DNA促旋酶相似。喹诺酮结合于拓扑异构酶IV/DNA促旋酶-DNA复合物，导致酶的构象改变，产生喹诺酮的抗菌活性[2，3]。
本实验旨在分析MhQRDR突变与对莫西沙星耐药的关系，并探讨Mh对喹诺酮的耐药机制，以便指导临床用药。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1菌株Mh血清型1标准株（ATCC27813）由南华大学病原生物研究所提供；Mh血清型1临床分离株一份，携带者为本院妇产科确诊患者，经药敏试验显示对左氧氟沙星、司帕沙星和莫西沙星均敏感。标本采自其宫颈分泌物。标本的血清型由本院检验科试验后确定。
1.1.2药物莫西沙星（Moxifloxacin）原料粉剂由常州市亚邦医药研究所有限公司提供，按照说明书要求用灭菌蒸馏水溶解，配成2048mg/L的贮藏液，过滤除菌后置-4℃保存备用。
1.1.3试剂基因组DNA提取试剂盒、PCRPfuMix、Marker等试剂由上海生工生物工程技术服务有限公司提供；Mh液体和固体培养基由南华大学微生物学教研室提供。
1.2实验方法
1.2.1临床株组取Mh血清型1临床分离株在琼脂培养基上划板并培养，然后挑取单个菌落（记作Mh0）用液体培养基培养扩增。测定莫西沙星对增菌产物的最低抑菌浓度。MIC的判断标准为在未添加莫西沙星的培养管中出现由红到黄的颜色改变的时间内（在37℃中培养24h），添加了莫西沙星的培养管未出现颜色改变的抗生素的最低浓度，即24h内颜色未改变的最末一管的药物浓度就是莫西沙星对此株Mh的MIC值，之后颜色才发生改变的试管内则含有耐药突变株。
1.2.2标准株组取Mh血清型1标准株在琼脂培养基上划板并培养，然后挑取单个菌落（记作Mh1）用液体培养基增菌。测莫西沙星对增菌产物的MIC，并提取增菌产物的DNA，用PCR对其gyrA、gyrB、parC、parE的QRDR进行扩增，然后对扩增产物进行测序。
1.3操作步骤
1.3.1MIC测定方法取15支无菌试管，均加入2ml培养基。将2ml2048mg/L的莫西沙星加入第1管，然后在第1管至第13管中进行倍比稀释。再将2ml1×107ccu/ml的菌液加入第1管至第13管。第14管中加入2ml2048mg/L的莫西沙星作为阴性对照，第15管中加入2ml1×107ccu/ml的菌液作为阳性对照。每次测MIC均采用标准株进行质控。
1.3.2模板DNA的提取方法按照基因组DNA提取试剂盒说明书进行。
2实验结果
6份Mh标本相对于莫西沙星的MIC测定结果及QRDR突变情况见表2。
表26份Mh标本的MIC结果及QRDR的密码子和氨基酸改变情况
－表示该位点无密码子和氨基酸改变
3讨论
对6份标本各自的4段基因的QRDR序列进行比较，并结合莫西沙星对它们的MIC进行分析，本文作者发现，Mh0并未对莫西沙星产生耐药，并且Mh0的QRDR与标准株Mh1一致；而Mh1A、Mh1B、Mh2A和Mh2B的QRDR均有突变，它们对莫西沙星均产生了耐药。因此，可以认为是QRDR突变导致了Mh对莫西沙星的耐药。
综上所述，本文作者认为，QRDR的点突变可导致Mh对莫西沙星产生耐药，莫西沙星对Mh的首要靶酶是拓扑异构酶IV。
参考文献：
[1]BiswasS，RaoultD，RolainJM.MolecularmechanismsofresistancetoantibioticsinBartonellabacilliformis.JAntimicrobChemother.2007Jun；59（6）：1065-70.Epub2007Apr21
[2]HawkeyPM.Mechanismsofquinoloneactionandmicrobialresponse.JAntimicrobChemother，2003，51（S1）：29-35
[3]DrlicaK，MalikM.Fluoroquinolones：actionandresistance.CurrTopMedChem，2003，3（3）：249-282
[4]BebearCM，RenaudinH，CharronA，etal.DNAGyraseandTopoisomeraseIVMutationsinClinicalIsolatesofUreaplasmaspp.andMycoplasmahominisResistanttoFluoroquinolones.AntimicrobialAgentsandChemotherapy，2003，47（10）：3323-3325
通资助项目：基金项目：国家自然科学基金资助项目（31300156）