牛副结核病多重组抗原间接ELISA方法的建立及应用

论文摘要

为了建立一种有效的牛副结核病间接ELISA方法，本研究设计了两对引物，从副结核分枝杆菌P18株的基因组中PCR扩增出两个目的基因map0862和map2154c、，采用重叠延伸剪接技术（splice by overlapping extension，SOE）获得融合基因map0862-2154c。经过多次亚克隆步骤后，将DNA片段map0862-2154c串连于表达载体pET32a（+）中，获得了重组质粒pET0862-2154c。将重组质粒转化BL21（DE3）大肠杆菌感受态后，经IPTG诱导表达后，以Ni2+鳌合层析的方法纯化融合蛋白。Western blot分析表明重组蛋白具有良好的免疫反应活性。以融合蛋白作为包被抗原，在确定了最佳封闭液和最佳包被条件后。采用正交试验设计的方法摸索了最佳抗原、一抗和二抗稀释度，以及最佳一抗、二抗作用时间和显色时间，建立了检测牛副结核病抗体的间接ELISA方法。用95份健康牛血清的检测结果统计分析后确定诊断方法的判定标准，即牛血清样本（mbp0862-2154c）S／P大于0.42为阳性，小于0.34为阴性，两者之间为可疑。通过对90份牛副结核病血清和100份无副结核病牛血清的检测结果表明，ELISA方法的敏感性为84.44％（76／90），特异性为97％（97／100）。用确定的间接ELISA方法对50份副结核阴性血清（副结核病试剂盒检测）和54份副结核阳性血清（副结核病试剂盒检测）共104份检测，检测结果进行比较，本方法与牛副结核病试剂盒（IDEXX）诊断的符合率为91.35％。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 国内外研究现状
• 1.1 副结核病的概述
• 1.2 牛副结核病的流行和控制
• 1.3 牛副结核病诊断技术的研究进展
• 1.4 牛副结核病的防疫对策
• 2 研究目的和意义
• 3 研究内容和方法
• 3.1 牛副结核分枝杆菌抗原MAP0862和MAP2154c的串连融合表达
• 3.2 间接ELISA诊断方法的建立及应用
• 第二章 实验部分
• 1 牛副结核分枝杆菌抗原MAP0862和MAP2154c融合表达
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 2 间接ELISA方法的建立及应用
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历