论文摘要
导致椎间盘退变的因素很多,而椎间盘的营养供应减少是其中的因素之一。椎间盘是人体最大的无血管组织,营养供应相对缺乏。椎间盘营养通过软骨终板和纤维环这两条途径扩散入椎间盘内,而椎间盘内髓核细胞的营养主要通过终板途径获得营养。随着年龄逐渐增加,软骨终板逐渐变薄、钙化,软骨终板的血管数量也就逐渐减少。髓核细胞营养供应相对缺乏,从而导致髓核细胞数量减少,最终导致椎间盘退变。葡萄糖是椎间盘髓核细胞的营养成分之一,葡萄糖是通过糖酵解的方式向椎间盘提供能量的,故椎间盘需要消耗大量的葡萄糖。在椎间盘软骨终板钙化的情况下,软骨终板限制了葡萄糖的通过,导致椎间盘髓核内葡萄糖浓度降低,进而导致髓核细胞活性降低和凋亡增加。本实验目的旨在研究低浓度葡萄糖对体外培养髓核细胞形态、生长及凋亡的影响,为椎间盘退变的病因学研究提供依据。一、人椎间盘髓核细胞的分离、培养及鉴定人髓核组织取自脊柱侧弯矫形手术患者,年龄在10-15岁,术前MRI检查证实椎间盘信号与正常椎间盘信号一致。所取标本在超净台上仔细分离出韧带、纤维环和软骨终板,剪碎髓核组织。0.25%的胰蛋白酶消化约40min。0.2%Ⅰ型胶原酶和0.2%Ⅱ型胶原酶混匀消化约3h,待髓核组织变成絮状物质后,用DF12+ 10%FBS终止消化。离心,去除组织残渣,加入DF12 +15%FBS培养液。细胞接种于培养瓶中,放置于培养箱中培养。培养过程中观察细胞形态学变化;MTT法绘制细胞生长曲线;甲苯胺蓝染色观察细胞形态;GAG和Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定细胞表型。结果:GAG染色和Ⅱ型胶原染色对细胞进行鉴定所得细胞为髓核细胞,甲苯胺蓝染色观察细胞形态正常,MTT法绘制生长曲线显示细胞生长良好。结论:胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶混合培养法所得髓核细胞形态正常,细胞生长良好,表型表达为髓核细胞,满足椎间盘体外实验研究。二、不同葡萄糖浓度的细胞培养液对体外培养椎间盘髓核细胞形态、生长和凋亡的作用实验中的髓核细胞为实验一中培养的细胞。实验分为四组:加入葡萄糖浓度为5mmol/L的培养液组（对照组）;加入葡萄糖浓度为2.5mmol/L的培养液组;加入葡萄糖浓度为1mmol/L的培养液组;加入葡萄糖浓度为0mmol/L的培养液组。MTT法绘制生长曲线;培养48h和72h后,相差显微镜观察髓核细胞形态变化;透射电镜下观察细胞超微结构变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果可以看到,随着培养液中葡萄糖浓度的不断降低,细胞数量也逐渐减少。这说明过低的葡萄糖浓度细胞培养液可抑制髓核细胞的增殖。对照组中,细胞呈多角形或短梭形。超微结构显示,细胞核为椭圆形,核膜完整,有1-3个大小不等的核仁。粗面内质网轻度扩张,线粒体结构正常。在2.5mmol/L组、1mmol/L组、0mmol/L组中,倒置显微镜下均可见到大量的长梭形细胞,胞质减少,折光性减弱等细胞衰老迹象。2.5mmol/L组、1mmol/L组中,透射电镜可观察到髓核细胞内大量溶酶体和脂肪滴,浓缩的核染色质边聚。0mmol/L中,透射电镜观察细胞内超微结构变化为,胞质内粗面内质网数目明显减少,细胞器破坏,胞膜不完整,部分细胞内可见到空泡及吞噬现象。流式细胞仪检测细胞凋亡率,随着葡萄糖浓度的降低,细胞凋亡率逐渐增高。结论:随着葡萄糖浓度的降低,人椎间盘髓核细胞的增殖被抑制,细胞凋亡率增加,细胞形态也发生改变。营养供应是椎间盘退变的重要因素之一,没有充足的葡萄糖供应,椎间盘髓核细胞不能长时间存活。髓核细胞活性和功能的维持有赖于糖酵解过程产生的能量。糖浓度降低导致细胞能量供应减少,细胞活性降低,凋亡增加等一系列细胞功能改变。