论文摘要
研究目的:研究低剂量NaNO2能否诱导CHL细胞产生氧化损伤的适应性反应,即体外培养的CHL细胞先接触低剂量NaNO2一段时间后,能否产生对大剂量NaNO2的细胞毒性及遗传毒性的抵抗力,并阐明其剂量—效应关系。探讨聚ADP核糖聚合酶（polyADP-ribose polymerases,PARP-1）在低剂量NaNO2诱导适应性反应形成过程中的作用。研究结果可为确定NaNO2的安全接触剂量提供参考依据。研究方法:1、采用MTT试验观察NaNO2对体外培养的中国仓鼠肺细胞（Chinese hamster lung cells,CHL cells）的细胞毒性作用,确定其最大无作用剂量（no observed active effect lever,NOAEL）,并以低于NOAEL的剂量预处理细胞6h,观察其对随后大剂量染毒的抵抗力。2、采用CHL细胞染色体畸变分析法、单细胞凝胶电泳试验及流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期的方法研究低剂量NaNO2诱导CHL细胞在遗传毒性作用方面的适应性反应及其剂量-反应关系。3、采用PARP-1的特异性抑制剂3-氨基苯甲酰胺（3-aminobenzamide,3-AB）抑制CHL细胞的PARP-1活性后,观察其对低剂量NANO2诱导CHL细胞适应性反应的影响,从而探讨PARP-1蛋白在适应性反应形成过程中的作用。4、采用western-blot技术检测不同剂量NaNO2作用6h后,CHL细胞PARP-1蛋白表达量的改变,从而进一步弄清PARP-1在适应性反应中的作用。研究结果:1、MTT试验结果显示,1.52mg/L～40mg/L的NaNO2作用于CHL细胞24h,可以促进细胞增殖,其细胞存活率高于正常对照组,表现出明显的hormesis效应;0.0005mg/L～0.01mg/L的NaNO2作用6h,可诱导CHL细胞产生对1g/L大剂量NaNO2细胞毒性作用的适应性反应;但是,低剂量NaNO2预处理不能诱导CHL细胞对更高剂量（如5g/L）的NaNO2产生适应性反应。2、CHL细胞染色体畸变试验的结果显示,当NaNO2的剂量高于128mg/L时即可诱导CHL细胞染色体畸变率的增加,染色体畸变类型有断裂、交换、双着丝粒、环状染色体、多倍体等。0.5mg/L～2.5mg/L的NaNO2预处理CHL细胞6h,则可使后续1.5g/L大剂量NaNO2染毒导致的染色体畸变率的增加幅度明显降低,表现出一定程度的适应性反应。在采用3AB抑制PARP-1的活性的情况下,可观察到适应性反应被阻断。3、单细胞凝胶电泳试验的结果显示,剂量高于200mg/L的NaNO2作用于CHL细胞18h,可导致细胞DNA的明显损伤,表现为细胞拖尾率的增加,拖尾程度加重,与正常对照组相比,其差异有统计学意义。0.01mg/L～0.1mg/L的NaNO2预处理CHL细胞6b,可减轻随后1g/L大剂量NaNO2染毒造成的DNA的损伤程度,表现出明显的适应性反应。在低剂量NaNO2预处理CHL细胞6h后,采用3AB抑制PARP-1的活性,不会阻断适应性反应的产生;而在低剂量预处理CHL细胞之前,即用3AB抑制PARP-1的活性,则可以阻断适应性反应的产生。4、对细胞凋亡率及细胞周期的观察结果显示,剂量高于1.5g/L的NaNO2作用于CHL细胞18h,可导致细胞凋亡率的明显升高,细胞发生明显的G1期阻滞,S期及G2期细胞比例减少,细胞的DNA相对含量及增殖指数均降低,表明细胞的DNA受到了较为严重的损伤;以0.01mg/L～0.1mg/L的NaNO2预处理CHL细胞6h,可明显降低随后1.5g/L大剂量NaNO2染毒导致的细胞凋亡率的增加,并使G1期的阻滞现象明显减轻,S期及G2期细胞比例增加,细胞的DNA相对含量及增殖指数均有所上升,表明细胞对DNA损伤的修复能力增强。3AB可抑制低剂量NaNO2诱导的DNA损伤修复能力,表现为S期细胞比例的明显减少,DNA相对含量及细胞增殖指数的下降;但3AB不会抑制低剂量NaNO2诱导的促凋亡作用。5、0.1mg/L的NaNO2作用于CHL细胞6h后,通过Western-blot试验可观察到分子量为116KD的PARP-1蛋白条带显色变浅,推测这一现象与PARP-1通过磷酸化的ERK2途径被激活,发生自身聚ADP核糖基化作用,形成大量聚ADP核糖聚合体,从而使其分子量发生改变有关。1g/L剂量组的蛋白条带也变浅,原因可能是1g/L大剂量的NaNO2导致CHL细胞DNA较严重的损伤,从而也使其PARP-1蛋白经DNA损伤途径大量被激活,形成聚ADP核糖聚合体的缘故。结论:1、0.01mg/L～0.1mg/L剂量范围的NaNO2可诱导CHL细胞对1.0g/L和1.5g/L剂量NaNO2染毒所致的损伤作用的适应性反应;低剂量NaNO2不能诱导CHL细胞对更高剂量（如5g/L）NaNO2的毒性作用的适应性反应。2、低剂量NaNO2具有毒物刺激作用（即hormesis效应）,其对CHL细胞的hormeticzone的剂量范围并不与其能诱导适应性反应的剂量范围重叠,适应性反应的剂量范围低于hormetic zone的下限。据此可以认为,hormesis效应是NaNO2对CHL细胞的遗传物质造成损伤的预警信号,能诱导适应性反应的剂量才是真实的安全剂量。3、PARP-1蛋白在低剂量NaNO2诱导CHL细胞氧化损伤适应性反应的形成过程中具有关键性的作用。当低剂量NaNO2作用于CHL细胞时,CHL细胞的PARP-1很可能通过磷酸化的ERK2激活途径被激活,从而增强细胞DNA损伤的修复能力,并促使不可修复的细胞发生凋亡。PARP-1蛋白是细胞DNA损伤修复时所必需的蛋白,如果其活性被抑制,则DNA损伤的修复过程也将被抑制;但PARP-1蛋白却不是细胞凋亡所必需的蛋白,抑制PARP-1的活性,并不能阻止细胞发生凋亡,PARP-1很可能只是细胞凋亡的起始因素之一,需要通过激活其下游的其它凋亡相关基因而发挥作用。4、本研究的受试生物体为中国仓鼠肺细胞,由于受到种属特性的限制,以上结论尚不能外推于人。有必要进一步对整体动物或人的体细胞进行研究。
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