论文摘要
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种神经退行性疾病，其病理特征为脑内可溶性β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）的过度沉积形成的老年斑与神经元纤维缠结。AD发病机制学说包括：氧化应激﹑炎症﹑胆碱能﹑钙稳态失衡﹑Tau蛋白异常修饰﹑早老素基因突变﹑载脂蛋白E基因突变以及Aβ损伤等学说。众多发病机制中，Aβ作为AD发病始动因子的观点己被广泛认可。Aβ是I型跨膜蛋白淀粉样蛋白前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）经过β-分泌酶（BACE-1）和γ-分泌酶（γ-secretase）顺序剪切的产物，根据其氨基酸片段的长度大致可分为Aβ25-35﹑Aβ1-40及Aβ1-42等。Aβ1-42片段最长，毒性最大，在神经变性过程中作用最强。现阶段用于AD研究的动物模型主要有各型转基因小鼠，快速老化小鼠（SAM）以及通过海马CA1区或者侧脑室注射Aβ诱导的动物模型。转基因鼠虽可模拟人类老年痴呆的神经病理特征，但经常表现为无或极少的老年斑沉积，细胞死亡有限及学习认知功能损害多变。既往大量研究利用可溶性Aβ寡聚体对动物进行干预进而诱导制备AD模型，但能否诱导出可靠的AD相关的学习记忆损害仍存在较大争议，部分学者认为AD相关的学习记忆损害是Aβ与其他因素相互作用的结果。AD患者不但脑内有Aβ的沉积，而且同时伴有相关血清性激素水平的降低，血清睾酮水平降低是年龄相关性男性AD患者的危险因素。生理水平的雄激素对空间学习记忆具有改善作用，然而也有研究显示睾酮与空间学习记忆无关或呈负相关。雄激素对内源性Aβ发挥负性调节作用，年龄相关性的雄激素丢失将增加脑内Aβ的水平并相应增加AD患病的风险。雄激素调节Aβ的机制还不清楚，但可能涉及三个常规途径中的一个或多个，即通过雄激素受体（androgen receptor，AR）依赖的途径直接发挥作用；通过睾酮芳香化为雌二醇，间接通过雌激素发挥作用；通过对下丘脑-垂体-性腺轴的调节间接发挥作用。AR在脑内主要负责学习记忆的功能区高表达，海马对空间记忆的获得发挥至关重要的作用。睾酮对空间学习记忆的作用可能是通过局部芳香化为雌二醇或者通过与海马局部AR直接作用实现的。体内雄激素水平与认知功能密切相关，但雄激素究竟通过何种机制影响认知功能目前还无定论。近年，突触的形态异常在AD发病中的作用逐渐受到重视，突触的异常改变可能是AD发病机制中的核心环节。性激素与突触可塑性（synaptic plasticity）的调节具有相关性。雌激素水平的升高可诱导学习记忆相关脑区产生新的突触和树突。雄激素对突触可塑性调节的作用和机制近些年也开始得到重视。海马参与近期空间学习记忆的获取、再现及巩固，是AD最早受累的病变部位。因此，本研究欲采取双侧海马CA1区可溶性Aβ1-42寡聚体注射联合去势模型（复合模型）大鼠，通过Morris水迷宫检测能否诱导出可靠的空间学习记忆的损害；探讨睾酮能否改善复合模型大鼠空间学习记忆的损害；同时对动物血清睾酮浓度进行检测，探讨血清睾酮浓度与空间学习记忆表现之间的关系；通过给予AR拮抗剂氟他胺验证睾酮是否通过依赖特异性的AR来发挥作用。此外，通过检测突触相关蛋白SYN与PSD-95表达量有无变化，并且通过对CaMK II（p-CaMK II）﹑CREB（p-CREB）及BDNF的检测探讨可能的信号传导通路。第一部分Aβ1-42寡聚体联合去势诱导的空间学习记忆损害大鼠模型的建立目的：观察双侧海马CA1区可溶性Aβ1-42寡聚体注射联合去势能否诱导出可靠的AD相关的学习记忆功能的损害，并探讨Aβ1-42与去势对大鼠空间学习记忆是否具有协同作用。方法：实验一：雄性SD大鼠40只，随机分为4组（每组10只），分别为正常对照组（gonadally-intact group，GI group）﹑假手术组（shamgonadally-intact group，SGI group）﹑溶剂对照组（Vehicle group）以及Aβ组（Aβ group）。实验二：雄性SD大鼠30只，随机分为3组（每组10只），分别为正常对照组（Intact group）﹑去势假手术组（Sham group）以及去势组（GDXgroup）。实验三：雄性SD大鼠50只，随机分为5组（每组10只），分别为对照组（Control group）﹑Aβ组（Aβ group）﹑复合模型假手术组（S-Aβ+GDX group）﹑复合模型组（Aβ+GDX group）﹑去势组（GDXgroup）。双侧海马CA1区埋管：实验动物经2%戊巴比妥钠（40-60mg/kg）腹腔注射麻醉，固定于脑立体定位仪。暴露前囟（bregma），参照大鼠脑图谱，以前囟为始点，向后3.8mm，中线左﹑右2.5mm处垂直颅骨表面进行打孔，垂直颅骨表面进针2.9mm（以颅骨外表面为基点），用牙科水泥固定。可溶性Aβ1-42寡聚体双侧海马CA1区注射：动物于海马CA1区埋管1周后进行可溶性Aβ1-42寡聚体双侧海马CA1区注射。每侧5min内缓慢注入5μLAβ1-42（2μg/μL）。行为学测试：术后第15天至第20天进行Morris水迷宫测试。定位航行实验历时5天，每天训练4次。记录大鼠定位航行实验的逃避潜伏期﹑上台前路程及平均游泳速度。第6天进行空间探索实验，记录动物120s内穿越平台的次数及在平台所在象限停留的时间百分比等指标。标本制备与处理：空间探索实验测试结束后24小时，所有动物深度麻醉，心脏穿刺采血0.5mL，置于抗凝管内。静置30min后进行低温超速离心，4℃，5000rpm，离心20min，取上清分装于无菌EP管内，-80℃存放以备放射免疫法检测血清睾酮浓度所用。5只大鼠断头取脑，冰浴剥离双侧海马，-80℃存放以备后用。5只动物取脑组织，常规组织固定，脱水，透明，石蜡包埋。制备5μM病理切片，进行尼氏染色。结果：1可溶性Aβ1-42寡聚体对SD成年雄性大鼠空间学习记忆的影响定位航行实验结果显示，逃避潜伏期与上台前路程组间均存在显著性差异（P <0.01）。而正常对照组﹑假手术组与溶剂对照组三组之间无显著性差异。Aβ组逃避潜伏期在第4天（P <0.05）与第5天（P <0.001）与其他各组存在显著性差异，较正常对照组明显增加。Aβ组上台前路程在第5天（P <0.05）与其他各组存在显著性差异，较正常对照组明显增加。平均游泳速度组间及组内均无差异。空间探索实验结果显示，各组在目标象限的时间百分比存在显著性差异（P <0.05），Aβ组在目标象限的时间百分比较正常对照组明显减小（P <0.05），而正常对照组﹑假手术组与溶剂对照之间无差异。穿越平台次数各组间也存在显著性差异（P <0.05），Aβ组较正常对照组穿越平台次数明显减小（P <0.05），而正常对照组﹑假手术组与溶剂对照之间无差异。血清睾酮放射免疫结果显示，各组之间无差异。尼氏染色细胞计数结果显示，正常对照组﹑假手术组及溶剂对照组大鼠CA1区完整锥体神经元的数量无差异。与正常对照组相比，Aβ组海马CA1区完整锥体神经元数量（55.6%）显著减少（P <0.001）。2去势对SD成年雄性大鼠空间学习记忆的影响定位航行实验结果显示，各组间逃避潜伏期（P <0.01）与上台前路程（P <0.05）组间存在显著性差异。去势组在第4天（P <0.05）与第5天（P <0.001）逃避潜伏期较正常对照组明显增加，其他三天组间无差异。去势组在第4天（P <0.05）与第5天（P <0.001）上台前路程较正常对照组明显增加，其他三天组间无差异。而平均游泳速度组间及组内均无差异。空间探索实验结果显示，各组在目标象限的时间百分比存在显著性差异（P <0.05）。去势组在目标象限的时间百分比较正常对照组明显减小（P <0.05），而正常对照组与假手术组之间无差异。各组穿越平台次数存在显著性差异（P <0.05），穿越平台次数去势组较正常对照组明显减小（P <0.05），而正常对照组与假手术组之间无差异。血清睾酮放射免疫结果显示，血清睾酮浓度各组之间存在显著性差异（P <0.001），去势组动物血清睾酮浓度显著降低，与正常对照组相比存在显著性差异（P <0.001）。尼氏染色细胞计数结果显示，对照组与假手术组CA1区完整锥体神经元的数量无差异；与对照组相比，去势组海马CA1区完整锥体神经元数量（47.0%）显著减少（P <0.001）。3双侧海马可溶性Aβ1-42寡聚体注射联合去势对SD成年雄性大鼠空间学习记忆的影响定位航行实验结果显示，逃避潜伏期与上台前路程各组间均存在显著性差异（P <0.001）。Aβ+GDX组逃避潜伏期在第3-5天（第3天（P <0.05），第4天（P <0.001），第5天（P <0.001））与其他各组相比存在显著性差异。Aβ+GDX组上台前路程在第4天（P <0.05）与第5天（P <0.001）与其他各组相比存在显著性差异。与同一天Control组相比，逃避潜伏期与上台前路程明显增加。动物平均游泳速度组间及组内均无差异。空间探索实验结果显示，各组在目标象限的时间百分比存在显著性差异（P <0.05）。与Control组相比，Aβ+GDX组在目标象限的时间百分比明显减小（P <0.05），而Control组与S-Aβ+GDX组之间无差异。穿越平台次数各组存在显著性差异（P <0.001），Aβ+GDX组穿越平台次数较Control组明显减小（P <0.001），Control组与S-Aβ+GDX组之间无差异。血清睾酮放射免疫结果显示，血清睾酮浓度各组之间存在显著性差异（P<0.001）。尼氏染色细胞计数结果显示，Control组与S-Aβ+GDX组大鼠CA1区完整锥体神经元的数量无差异。Aβ+GDX组与其他各组相比均存在显著性差异（P <0.001），海马CA1区完整锥体神经元数量最少，神经元数量与Control组相比下降82.8%。结论：1双侧海马可溶性Aβ1-42寡聚体对大鼠空间学习记忆能力具有损害作用。2去势对大鼠空间学习记忆能力具有损害作用。3双侧海马可溶性Aβ1-42寡聚体注射联合去势对大鼠空间学习记忆能力的损害作用较单纯Aβ1-42寡聚体注射或去势更严重，二者具有协同作用，复合模型动物更适合用于对老年期AD发病机制的研究。第二部分睾酮对Aβ1-42寡聚体联合去势诱导的空间学习记忆损害的保护作用目的：探讨睾酮能否改善复合模型大鼠空间学习记忆能力的损害；探讨血清睾酮浓度与空间学习记忆表现之间的关系；通过给予AR拮抗剂氟他胺（flutamide）验证睾酮是否通过依赖特异性AR来发挥作用。方法：实验一：56只复合模型大鼠随机分为7组，每组8只。7组动物给予皮下注射0.75mg睾酮，分别在给药后0，6，12，24，48，72与96h进行心脏穿刺采血测量血清睾酮浓度。实验二：56只复合模型大鼠造模12天后，随机分为7组，每组8只。于行为学测试的前两天开始给药，一直到行为学实验结束，连续给药共8天。各组分别皮下注射给予不同剂量的睾酮，即0.25，0.50，0.75，1.00，1.50与2.00mg，0mg组单纯给予等剂量的芝麻油。实验三：32只复合模型大鼠造模12天后，随机分为4组（每组8只），即复合模型对照组（C-Aβ+GDX group），睾酮组（T-Aβ+GDX group），氟他胺组（F-Aβ+GDX group），氟他胺+睾酮组（F+T-Aβ+GDX group）。睾酮于实验前2天以及行为学测试的6天内皮下注射。氟他胺于每天行为学测试前1h通过微量注射器给药，每侧海马5μg。行为学测试：同第一部分。标本制备与处理：实验一在各时间点进行血标本收集，实验二﹑三血液处理同第一部分。实验二﹑三每组各4只大鼠断头取脑，冰浴剥离双侧海马，-80℃存放以备后用。各组剩余动物留取组织标本用于组织切片的制备，具体方法同第一部分。尼氏染色（Nissl staining）及细胞计数：同第一部分。结果：1复合模型大鼠睾酮注射后不同时间点血清浓度各时间点血清睾酮浓度存在显著性差异（P <0.001）。其他各给药组血清睾酮浓度均高于0h组，给药48小时后血清睾酮浓度达到高峰。2不同剂量睾酮对复合模型大鼠空间学习记忆表现的影响各剂量组动物逃避潜伏期（P <0.001）与上台前路程（P <0.01）均存在显著性差异。各剂量组逃避潜伏期在第4天（P <0.01）与第5天（P <0.001）存在显著性差异。0.75mg组在第4天（P <0.01）与第5天（P <0.001）较0mg组逃避潜伏期明显缩短。各剂量组上台前路程在第4天（P <0.05）和第5天（P <0.001）存在显著性差异。0.75mg组较0mg组上台前路程明显的减小。平均游泳速度组间及组内均无显著性差异。空间探索实验结果显示，各剂量组在目标象限的时间百分比存在显著性差异（P <0.05）。0.75mg组在目标象限的时间百分比在各剂量组中最大，较0mg组明显增加（P <0.05）。穿越平台次数各剂量组存在显著性差异（P <0.001），0.75mg组穿越平台次数在各剂量组中最大，较0mg组明显增加（P <0.001）。血清睾酮浓度各剂量组之间存在显著性差异（P <0.001），与给药剂量呈剂量依赖性关系。尼氏染色细胞计数结果显示，从0.25mg到1.00mg组完整锥体神经元的数量随睾酮给药剂量的增加而逐渐增多，与0mg组相比均存在显著性差异（P <0.001）；其中，0.75mg组大鼠CA1区完整锥体神经元的数量最多，较0mg组升高了162.6%。3AR拮抗剂氟他胺对复合模型大鼠空间学习记忆表现的影响定位航行实验结果显示，逃避潜伏期（P <0.001）与上台前路程（P <0.05）各组间存在显著性差异，而C-Aβ+GDX组﹑F-Aβ+GDX组与F+T-Aβ+GDX组间无显著性差异。T-Aβ+GDX组较C-Aβ+GDX组逃避潜伏期明显缩短（P <0.01）。上台前路程各组间存在显著性差异（P <0.05），T-Aβ+GDX组较C-Aβ+GDX组上台前路程明显减小（P <0.01）。平均游泳速度组间及组内比较均无显著性差异。空间探索实验结果显示，各组在目标象限的时间百分比存在显著性差异（P <0.05）。T-Aβ+GDX组在目标象限的时间百分比在所有各组中最大，较C-Aβ+GDX组明显增加（P <0.05）。而C-Aβ+GDX组﹑F-Aβ+GDX组与F+T-Aβ+GDX组之间无显著性差异。穿越平台次数各组间存在显著性差异（P <0.001），T-Aβ+GDX组穿越平台次数在所有各组中最大，较C-Aβ+GDX组明显增加（P <0.001）。C-Aβ+GDX组﹑F-Aβ+GDX组与F+T-Aβ+GDX组之间无显著性差异。血清睾酮浓度各组之间存在显著性差异（P <0.001），而氟他胺对血清睾酮浓度无影响。尼氏染色细胞计数结果显示，T-Aβ+GDX组大鼠CA1区完整锥体神经元的数量最多，与其他各组相比差异显著（P <0.001）。F-Aβ+GDX组﹑F+T-Aβ+GDX组与C-Aβ+GDX组海马CA1区完整锥体神经元数量无显著性差异。结论：1适量体外补充睾酮可以改善复合模型大鼠空间学习记忆的损害。2复合模型大鼠空间学习记忆与血清睾酮浓度具有相关性。3氟他胺可以阻断睾酮对复合模型大鼠空间学习记忆的改善作用。4睾酮对复合模型大鼠空间学习记忆的改善作用部分是通过AR途径完成的。第三部分睾酮对Aβ1-42寡聚体联合去势诱导的空间学习记忆损害的保护作用的机制研究目的：通过对突触相关蛋白SYN与PSD-95，以及信号通路中BDNF﹑CaMK II（p-CaMK II）及CREB（p-CREB）的检测探讨睾酮影响空间学习记忆的可能信号机制，为雄激素改善空间学习记忆提供理论及实验基础。方法：应用Western blot与RT-PCR对SYN﹑PSD-95﹑BDNF﹑CaMK II（p-CaMK II）及CREB（p-CREB）进行检测。结果：1双侧海马可溶性Aβ1-42寡聚体注射联合去势对SYN及PSD-95的影响Western blot结果显示，Control组与S-Aβ+GDX组内SYN与PSD-95表达量相对较高，两组间上述指标无显著性差异；与Control组相比，Aβ组﹑GDX组及Aβ+GDX组SYN与PSD-95表达量明显减少，而Aβ+GDX组下降最显著，组间比较存在显著性差异（P <0.001）。RT-PCR结果与Western blot结果基本一致，β-actin mRNA扩增条带密度各组间无明显差异，提示各实验组上样量相等。Control组与S-Aβ+GDX组内SYN mRNA与PSD-95mRNA的扩增产物相对较高，条带密度两组间无显著性差异；Aβ组﹑GDX组及Aβ+GDX组与Control组相比SYN mRNA与PSD-95mRNA的扩增产物明显减少，而Aβ+GDX组下降最显著，条带密度组间比较存在显著性差异（P <0.001）。2睾酮对SYN及PSD-95表达量的影响Western blot结果显示，SYN与PSD-95在C-Aβ+GDX组﹑F-Aβ+GDX组与F+T-Aβ+GDX组大鼠海马组织内表达量较低，组间比较均无显著性差异；T-Aβ+GDX组与C-Aβ+GDX组比较SYN（P <0.001）与PSD-95（P <0.01）表达量明显增加。RT-PCR结果显示，内参β-actin mRNA扩增条带密度各组间无明显差异，提示各组上样量相等。SYN mRNA与PSD-95mRNA的扩增产物在C-Aβ+GDX组﹑F-Aβ+GDX组与F+T-Aβ+GDX组间无明显差异，而T-Aβ+GDX组与C-Aβ+GDX组相比SYN mRNA（P <0.01）与PSD-95mRNA（P <0.001）的扩增产物显著增加。3睾酮对p-CaMK II/CaMK II表达量的影响Western blot结果显示， C-Aβ+GDX组﹑F-Aβ+GDX组与F+T-Aβ+GDX组p-CaMK II表达量较低，组间比较无显著性差异，T-Aβ+GDX组p-CaMK II表达量明显增加，与C-Aβ+GDX组比较有显著性差异（P <0.05），CaMK II表达量各组间无显著性差异。4睾酮对p-CREB/CREB表达量的影响Western blot结果显示，CREB表达量各组间无差异；C-Aβ+GDX组﹑F-Aβ+GDX组与F+T-Aβ+GDX组大鼠海马组织内p-CREB表达量较低，组间比较无显著性差异，T-Aβ+GDX组p-CREB表达量明显增加，与其他组比较有显著性差异（P <0.05）。5睾酮对BDNF表达量的影响Western blot结果显示， C-Aβ+GDX组﹑F-Aβ+GDX组与F+T-Aβ+GDX组BDNF表达量较低，组间比较无显著性差异，T-Aβ+GDX组BDNF表达量明显增加，与C-Aβ+GDX组比较有显著性差异（P <0.001）。RT-PCR结果显示，β-actin mRNA扩增条带密度各组间无明显差异，提示各实验组上样量一致。BDNF mRNA的扩增产物各组间无显著性差异，C-Aβ+GDX组﹑F-Aβ+GDX组与F+T-Aβ+GDX组内BDNFmRNA的扩增产物较少，条带密度组间比较无明显差别，而T-Aβ+GDX组BDNF mRNA的扩增产物明显增加，条带密度与C-Aβ+GDX组相比存在显著性差异（P <0.01）。结论：1双侧海马可溶性Aβ1-42寡聚体注射联合去势对大鼠空间学习记忆的损害可能与突触可塑性的改变有关。2睾酮改善复合模型大鼠空间学习记忆可能是通过Ca2+-CaM/CaMKII-p-CREB通路，进而提高BDNF以及突触相关蛋白SYN及PSD-95的表达，增强对突触可塑性的调节作用。
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